| 中文摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 目录 | 第10-15页 |
| 前言 | 第15-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-31页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎流行病学 | 第17-18页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎流行情况 | 第17页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎的传播及危害 | 第17-18页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎病原学 | 第18-19页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分类 | 第18页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌的理化特性 | 第18页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌的血清型分型 | 第18-19页 |
| ·胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子及致病机理 | 第19-23页 |
| ·Apx毒素 | 第19-21页 |
| ·ApxⅠ毒素 | 第20页 |
| ·ApxⅡ毒素 | 第20-21页 |
| ·ApxⅢ毒素 | 第21页 |
| ·ApxⅣ毒素 | 第21页 |
| ·荚膜(Capsule,CP) | 第21-22页 |
| ·脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS) | 第22页 |
| ·外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP) | 第22页 |
| ·转铁结合蛋白(transferrin binding proteins,TBP) | 第22页 |
| ·其他 | 第22-23页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎诊断方法研究进展 | 第23-26页 |
| ·病原分离鉴定 | 第23页 |
| ·血清学诊断方法 | 第23-25页 |
| ·补体结合试验(Complement Fixation Test,CFT) | 第23页 |
| ·酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunonsorbert Assay,ELISA) | 第23-24页 |
| ·凝集试验 | 第24页 |
| ·间接血凝试验(Indirect Hemagglntination Assay,IHA) | 第24页 |
| ·间接荧光抗体试验(Indirect Fluorescence Antibody Assay,IFA) | 第24页 |
| ·乳胶凝集试验(Latex Agglutination Test,LAT) | 第24-25页 |
| ·环状沉淀试验(Ring Prepitation Test) | 第25页 |
| ·免疫扩散试验(Immunodiffusion Test) | 第25页 |
| ·分子生物学诊断方法 | 第25-26页 |
| ·聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR) | 第25-26页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第26页 |
| ·DNA杂交试验 | 第26页 |
| ·猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展 | 第26-31页 |
| ·灭活苗 | 第26-27页 |
| ·弱毒苗 | 第27-28页 |
| ·亚单位疫苗 | 第28-29页 |
| ·核酸疫苗 | 第29页 |
| ·展望 | 第29-31页 |
| 第二部分 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA、apxⅡA、apxⅣA基因的克隆表达 | 第31-65页 |
| 概述 | 第31-32页 |
| 实验研究一 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因在大肠杆菌中的克隆表达及重组蛋白的纯化 | 第32-39页 |
| 1 材料与方法 | 第33-35页 |
| ·菌种、质粒和试剂 | 第33页 |
| ·APP基因组DNA的提取 | 第33页 |
| ·APP259标准阳性血清的制备 | 第33页 |
| ·ApxⅠA表达载体的构建 | 第33-34页 |
| ·apxⅠA基因在大肠杆菌DH5α中的表达 | 第34页 |
| ·包涵体的溶解及复性 | 第34-35页 |
| ·GST重组融合蛋白过柱纯化 | 第35页 |
| 2 结果 | 第35-37页 |
| ·ApxⅠA蛋白的特性分析 | 第35页 |
| ·apxⅠA基因的PCR扩增及测序 | 第35-36页 |
| ·重组质粒pGEX-4T-1/apxⅠA的鉴定 | 第36页 |
| ·apxⅠA基因在大肠杆菌DH5α中的表达 | 第36页 |
| ·包涵体的溶解及复性 | 第36-37页 |
| ·GST融合蛋白的过柱纯化及浓度测定 | 第37页 |
| 3 讨论 | 第37-39页 |
| 实验研究二 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因在毕赤酵母中的表达与分析 | 第39-45页 |
| 1 材料与方法 | 第40-42页 |
| ·菌种、质粒和试剂 | 第40页 |
| ·培养基的配制 | 第40页 |
| ·PCR模板的制备 | 第40页 |
| ·引物的设计和合成 | 第40-41页 |
| ·apxⅠA基因的扩增及测序: | 第41页 |
| ·ApxⅠA真核表达载体的构建 | 第41页 |
| ·分析apxⅠA基因密码子及预测相关表达特性 | 第41页 |
| ·ApxⅠA在毕赤酵母GS115中的表达及检测 | 第41-42页 |
| 2 结果 | 第42-44页 |
| ·apxⅠA基因的PCR扩增及测序 | 第42页 |
| ·apxⅠA基因真核表达载体的构建 | 第42页 |
| ·分析apxⅠA基因密码子及预测相关表达特性 | 第42-43页 |
| ·apxⅠA基因的表达及检测 | 第43-44页 |
| 3 讨论 | 第44-45页 |
| 实验研究三 胸膜肺炎放线杆菌apxⅡA基因在大肠杆菌中的克隆表达及重组蛋白的纯化 | 第45-52页 |
| 1 材料与方法 | 第46-48页 |
| ·菌种、质粒和试剂 | 第46页 |
| ·APP基因组DNA的提取 | 第46页 |
| ·APP265阳性血清的制备 | 第46页 |
| ·ApxⅡA表达载体的构建 | 第46-47页 |
| ·引物的设计和合成 | 第46-47页 |
| ·apxⅡA基因的扩增及测序: | 第47页 |
| ·apxⅡA基因原核表达载体的构建 | 第47页 |
| ·apxⅡA基因在大肠杆菌DH5α中的表达 | 第47页 |
| ·包涵体的洗涤、溶解和复性 | 第47页 |
| ·6×His重组融合蛋白过柱纯化 | 第47-48页 |
| 2 结果 | 第48-50页 |
| ·ApxⅡA蛋白的特性分析 | 第48页 |
| ·apxⅡA基因的PCR扩增及测序 | 第48页 |
| ·重组质粒pET32a/apxⅡA的鉴定 | 第48-49页 |
| ·apxⅡA基因在大肠杆菌BL21中的表达 | 第49页 |
| ·包涵体的溶解及复性 | 第49页 |
| ·6×His融合蛋白的过柱纯化及浓度测定 | 第49-50页 |
| 3 讨论 | 第50-52页 |
| 实验研究四 胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因在大肠杆菌中的克隆表达及重组蛋白的纯化 | 第52-58页 |
| 1 材料与方法 | 第53-55页 |
| ·菌种、质粒和试剂 | 第53页 |
| ·APP基因组DNA的提取 | 第53页 |
| ·APP259活菌阳性血清的制备 | 第53-54页 |
| ·ApxⅣA表达载体的构建 | 第54页 |
| ·引物的设计和合成 | 第54页 |
| ·apxⅣA基因的扩增及测序: | 第54页 |
| ·apxⅣA基因原核表达载体的构建 | 第54页 |
| ·apxIVA基因在大肠杆菌DH5α中的表达 | 第54页 |
| ·包涵体的溶解及复性 | 第54-55页 |
| ·GST重组融合蛋白过柱纯化 | 第55页 |
| 2 结果 | 第55-57页 |
| ·apxⅣA基因的PCR扩增及测序 | 第55页 |
| ·重组质粒pGEX-4T-1/apxⅣA的鉴定 | 第55-56页 |
| ·apxⅣA基因在大肠杆菌DH5α中的表达 | 第56页 |
| ·包涵体的溶解及复性 | 第56页 |
| ·GST融合蛋白的过柱纯化及浓度测定 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-58页 |
| 实验研究五 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA-apxⅡA融合基因在大肠杆菌中的共表达 | 第58-65页 |
| 1 材料与方法 | 第59-61页 |
| ·菌种、质粒和试剂 | 第59页 |
| ·APP基因组DNA的提取 | 第59页 |
| ·ApxⅠA和ApxⅡA共表达载体的构建 | 第59-60页 |
| ·引物的设计和合成 | 第60页 |
| ·apxⅠA和apxⅡA基因的扩增及测序: | 第60页 |
| ·apxⅠA和apxⅡA基因共表达载体的构建 | 第60页 |
| ·ApxⅠA和ApxⅡA在大肠杆菌Top 10'F中的共表达 | 第60页 |
| ·包涵体的溶解及复性 | 第60-61页 |
| ·GST重组融合蛋白过柱纯化 | 第61页 |
| 2 结果 | 第61-63页 |
| ·apxⅠA和apxⅡA基因的PCR扩增及测序 | 第61-62页 |
| ·重组质粒pGEX-4T-1/apxⅠA-apxⅡA的鉴定 | 第62页 |
| ·ApxⅠA和ApxⅡA在大肠杆菌Top 10'F中的共表达 | 第62页 |
| ·包涵体的溶解及复性 | 第62页 |
| ·GST融合蛋白的过柱纯化及浓度测定 | 第62-63页 |
| 3 讨论 | 第63-65页 |
| 第三部分 多重实时定量PCR鉴别诊断猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型方法的建立 | 第65-73页 |
| 1 材料与方法 | 第66-68页 |
| ·菌株及病毒 | 第66页 |
| ·引物及探针设计 | 第66页 |
| ·APP和PCV2 DNA模板的制备 | 第66页 |
| ·重组质粒的制备 | 第66-67页 |
| ·反应体系的优化 | 第67页 |
| ·颜色补偿试验 | 第67页 |
| ·标准曲线的建立和直线回归方程的确定 | 第67页 |
| ·特异性、敏感性、稳定性和干扰性分析 | 第67-68页 |
| ·特异性试验 | 第67页 |
| ·敏感性试验 | 第67-68页 |
| ·稳定性试验 | 第68页 |
| ·干扰性试验 | 第68页 |
| 2 结果 | 第68-71页 |
| ·APP apxⅣA和PCV2 ORF2部分基因片段的扩增及重组质粒的构建 | 第68页 |
| ·标准曲线的建立和直线回归方程的确定 | 第68页 |
| ·特异性、敏感性、稳定性和干扰性试验 | 第68-71页 |
| ·特异性试验 | 第68-69页 |
| ·敏感性试验 | 第69-70页 |
| ·稳定性试验 | 第70页 |
| ·干扰性试验 | 第70-71页 |
| 3 讨论 | 第71-73页 |
| 结论与展望 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-84页 |
| 实验用主要溶液的配制 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 个人简历 | 第86页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第86页 |
