| 目录 | 第1-8页 |
| 中文摘要 | 第8-11页 |
| 英文摘要 | 第11-14页 |
| 前言 | 第14-26页 |
| 1.鼠疫的危害 | 第14页 |
| 2.鼠疫菌的传播和治病过程 | 第14-16页 |
| 3.鼠疫菌的病原学特征 | 第16-19页 |
| ·生理生化特性 | 第16页 |
| ·基因组的结构及整体调节 | 第16页 |
| ·毒力决定因子 | 第16-19页 |
| ·血浆酶原激活因子(Pla蛋白酶) | 第18页 |
| ·鼠疫杆菌素Pst | 第18-19页 |
| ·鼠疫菌的Ⅲ型分泌系统 | 第19页 |
| 4.细菌基因表达调控 | 第19-21页 |
| ·细菌生物的基因调控特点 | 第19页 |
| ·细菌基因调控机制的类型与特点 | 第19-20页 |
| ·细菌的转录调控子与基因调控 | 第20页 |
| ·细菌毒力相关的转录调控子 | 第20-21页 |
| 5.鼠疫菌的基因调控研究概况 | 第21页 |
| 6.CRP的研究及进展 | 第21-23页 |
| ·降解物对基因活性的调节 | 第21-22页 |
| ·CAP的正性调控 | 第22-23页 |
| ·转录调控子CRP的研究进展 | 第23页 |
| 7.本研究的目的与总体研究计划 | 第23-26页 |
| 正文 | 第26-94页 |
| 1.材料 | 第26-28页 |
| ·菌株,质粒 | 第26页 |
| ·菌株 | 第26页 |
| ·质粒 | 第26页 |
| ·酶,试剂盒 | 第26-27页 |
| ·主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.方法 | 第28-51页 |
| ·△crp突变株的构建 | 第28-30页 |
| ·突变盒引物的设计与突变盒的扩增 | 第28-29页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第29页 |
| ·电转化 | 第29-30页 |
| ·重组克隆的筛选鉴定 | 第30页 |
| ·△crp突变株的回复株C-crp的构建 | 第30页 |
| ·鼠疫菌毒力表型实验 | 第30-31页 |
| ·体外生长曲线 | 第30页 |
| ·动物实验LD50的测定 | 第30-31页 |
| ·鼠疫菌细菌的脏器分布 | 第31页 |
| ·芯片表达谱分析 | 第31-34页 |
| ·培养条件 | 第31页 |
| ·鼠疫菌总RNA的提取 | 第31-32页 |
| ·菌体收集和RNA固定 | 第31页 |
| ·菌体裂解 | 第31页 |
| ·沉淀核酸 | 第31页 |
| ·消化DNA | 第31-32页 |
| ·沉淀RNA | 第32页 |
| ·总RNA的荧光素标记 | 第32-33页 |
| ·逆转录生成氨基标记的cDNA | 第32-33页 |
| ·氨基标记cDNA纯化 | 第33页 |
| ·氨基标记cDNA的荧光素标记与纯化 | 第33页 |
| ·芯片杂交及数据分析 | 第33-34页 |
| ·芯片的紫外交联与醛基封闭 | 第33-34页 |
| ·芯片的预杂交 | 第34页 |
| ·芯片杂交与漂洗 | 第34页 |
| ·数据分析 | 第34页 |
| ·Real-time PCR验证 | 第34-36页 |
| ·Trizol提取细菌RNA的方法 | 第34-35页 |
| ·Ambion's DNA-freeTM kit 去DNA污染 | 第35页 |
| ·逆转录 | 第35页 |
| ·Real-time PCR反应 | 第35-36页 |
| ·设计引物 | 第36页 |
| ·定量PCR | 第36页 |
| ·绘制相对标准曲线和待测基因的定量PCR验证 | 第36页 |
| ·CRP结合位点的生物信息学预测 | 第36-37页 |
| ·acZ报告基因融合实验 | 第37-41页 |
| ·设计引物 | 第37页 |
| ·原理见下图6 | 第37页 |
| ·目的DNA扩增和产物纯化 | 第37-38页 |
| ·pRS551质粒DNA的提取 | 第38页 |
| ·启动子DNA和载体DNA的双酶切 | 第38页 |
| ·酶切产物的连接 | 第38-39页 |
| ·感受态制备 | 第39页 |
| ·转化 | 第39页 |
| ·重组克隆鉴定 | 第39页 |
| ·克隆片段DNA测序 | 第39-40页 |
| ·质粒DNA提取 | 第40页 |
| ·鼠疫菌电转化感受态细胞的制备 | 第40页 |
| ·电转化 | 第40页 |
| ·PCR鉴定 | 第40-41页 |
| ·LacZ酶活性检测 | 第41页 |
| ·his-CRP蛋白的表达与纯化 | 第41-45页 |
| ·引物设计及合成 | 第41-42页 |
| ·产物的扩增与连接 | 第42页 |
| ·连接产物转化感受态大肠杆菌BL21 | 第42-43页 |
| ·阳性克隆的挑选及目的蛋白的表达 | 第43页 |
| ·目的蛋白的表达纯化 | 第43-44页 |
| ·菌体培养和诱导 | 第43-44页 |
| ·Ni柱纯化 | 第44页 |
| ·透析和浓缩 | 第44页 |
| ·BCA法测定CRP蛋白浓度 | 第44-45页 |
| ·凝胶迁移实验 | 第45-47页 |
| ·目的DNA片段的合成 | 第45页 |
| ·探针的标记 | 第45-46页 |
| ·结合百分比的测定 | 第46页 |
| ·未结合标记物的去除 | 第46页 |
| ·结合反应 | 第46-47页 |
| ·DNA酶Ⅰ足迹实验 | 第47-49页 |
| ·放射性γ-~(32)P-ATP标记引物 | 第47-48页 |
| ·靶DNA的标记 | 第48页 |
| ·足迹试验步骤 | 第48-49页 |
| ·放射性γ-~(32)P-ATP标记引物及测序反应 | 第49-50页 |
| ·用放射性γ-~(32)P-ATP标记引物 | 第49页 |
| ·测序反应 | 第49-50页 |
| ·引物延伸实验 | 第50-51页 |
| ·与靶基因mRNA互补引物的设计 | 第50页 |
| ·总RNA的提取 | 第50页 |
| ·寡核苷酸探针的制备 | 第50-51页 |
| ·引物延伸反应 | 第51页 |
| 3.结果 | 第51-78页 |
| ·△crp突变株及回复株-ccrP的构建 | 第51-52页 |
| ·毒力表型实验 | 第52-55页 |
| ·生长曲线 | 第52页 |
| ·LD50测定 | 第52-53页 |
| ·攻毒后小鼠生存率曲线 | 第53-54页 |
| ·细菌在脏器中分布 | 第54-55页 |
| ·CRP调控元 | 第55-62页 |
| ·芯片表达谱实验 | 第55页 |
| ·候选直接调控靶基因的预测 | 第55-56页 |
| ·实时定量RT-PCR | 第56-57页 |
| ·his-CRP蛋白的表达纯化和浓度的测定 | 第57-58页 |
| ·凝胶阻滞实验 | 第58-62页 |
| ·小结 | 第62页 |
| ·CRP对关键毒力基因调控的精细机制 | 第62-74页 |
| ·sycO-ypkA-yopJ操纵子的验证 | 第62-63页 |
| ·lacZ融合实验 | 第63-64页 |
| ·足迹实验 | 第64-67页 |
| ·引物延伸实验 | 第67-70页 |
| ·靶基因启动子区的结构 | 第70页 |
| ·CPR依赖的pal,sPt以及syco-ypkA-yopJ划少即J的启动子区的结构 | 第70-71页 |
| ·小结 | 第71-74页 |
| ·CRP基序的生物信息学分析 | 第74-78页 |
| ·CRP Box | 第74-75页 |
| ·CRP Matrix | 第75页 |
| ·全基因组生物信息学预测 | 第75-78页 |
| 4.讨论 | 第78-92页 |
| ·CRP是一个整体调控子 | 第78-79页 |
| ·CRP能激活两个水平转移获得的质粒pPCP1上的基因pla和pst | 第79页 |
| ·CRP和sycO-ypkA-yopJ操纵子 | 第79页 |
| ·Y.pestis中的CRP是一个毒力调控子 | 第79-80页 |
| ·CRP调控机制的小结 | 第80-92页 |
| 5.结语 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-97页 |
| 附录 | 第97-109页 |
| 1.药品,溶液,药品,配制方法 | 第97-105页 |
| 2.本研究中所用到的引物 | 第105-108页 |
| 3.缩略语 | 第108-109页 |
| 致谢 | 第109-111页 |
| 攻博期间主要学术成果 | 第111-112页 |
