| 摘要 | 第3-7页 |
| abstract | 第7-11页 |
| 中英文缩略词表 | 第17-19页 |
| 前言 | 第19-24页 |
| 第一章 FAT10在不同心肌肥厚模型中的表达情况 | 第24-50页 |
| 材料与方法 | 第24-39页 |
| 1.实验材料 | 第24页 |
| 2.主要实验设备及仪器 | 第24-25页 |
| 3.主要试剂及其配置 | 第25-30页 |
| 3.1 主要试剂 | 第25-26页 |
| 3.2 主要试剂配置 | 第26-30页 |
| 4.实验方法 | 第30-39页 |
| 4.1 大鼠无创血压测量 | 第30页 |
| 4.2 免疫组织化学染色 | 第30-32页 |
| 4.3 乳鼠原代心肌细胞培养 | 第32页 |
| 4.4 细胞总蛋白提取 | 第32-33页 |
| 4.5 组织蛋白提取 | 第33页 |
| 4.6 蛋白浓度的测定 | 第33页 |
| 4.7 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳与转印 | 第33-34页 |
| 4.8 蛋白质印记抗体标记与显色 | 第34-35页 |
| 4.9 细胞总RNA提取 | 第35页 |
| 4.10 逆转录PCR | 第35-36页 |
| 4.11 RT-PCR | 第36-37页 |
| 4.12 实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR) | 第37-38页 |
| 4.13 组织免疫荧光 | 第38-39页 |
| 4.14 利用高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)检索基因表达数据 | 第39页 |
| 4.15 统计学分析 | 第39页 |
| 结果 | 第39-47页 |
| 1.Fat10在心脏中表达 | 第39-41页 |
| 2.FAT10在AngII诱导的心肌细胞肥厚模型中表达下降 | 第41页 |
| 3.FAT10在SHR大鼠心脏中表达下降 | 第41-46页 |
| 3.1 验证SHR大鼠的心肌肥厚表型 | 第42-44页 |
| 3.2 检测肥厚心肌中FAT10mRNA与蛋白表达 | 第44-46页 |
| 4.FAT10在其它心肌肥厚模型中的表达 | 第46-47页 |
| 讨论 | 第47-49页 |
| 结论 | 第49-50页 |
| 第二章 FAT10对体外心肌肥厚的影响与分子机制的研究 | 第50-83页 |
| 材料与方法 | 第50-65页 |
| 1.实验材料 | 第50页 |
| 2.主要实验设备及仪器 | 第50-51页 |
| 3.主要试剂及其配置 | 第51-57页 |
| 3.1 主要试剂 | 第51-53页 |
| 3.2 主要试剂配置 | 第53-57页 |
| 4.实验方法 | 第57-65页 |
| 4.1 乳鼠原代心肌细胞培养 | 第57-58页 |
| 4.2 细胞总蛋白提取 | 第58页 |
| 4.3 组织总蛋白提取 | 第58页 |
| 4.4 蛋白浓度的测定 | 第58-59页 |
| 4.5 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳与转印 | 第59-60页 |
| 4.6 蛋白质印记抗体标记与显色 | 第60页 |
| 4.7 细胞总RNA提取 | 第60-61页 |
| 4.8 逆转录PCR | 第61页 |
| 4.9 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第61-62页 |
| 4.10 利用Langendorff灌流法分离大鼠心室肌 | 第62-63页 |
| 4.11 细胞免疫荧光 | 第63-64页 |
| 4.12 利用荧光标记的鬼笔环肽(Phalloidin)标记细胞F-actin | 第64页 |
| 4.13 心肌组织的免疫共沉淀反应 | 第64页 |
| 4.14 心肌组织蛋白质谱分析 | 第64-65页 |
| 4.15 统计分析 | 第65页 |
| 结果 | 第65-79页 |
| 1.过表达FAT10减轻AngII诱导的原代心肌细胞肥大 | 第65-68页 |
| 1.1 过表达FAT10减小AngII诱导的细胞表面积增大 | 第65-66页 |
| 1.2 过表达FAT10抑制肥大心肌中ANF与BNP的合成 | 第66-67页 |
| 1.3 过表达FAT10抑制肥大心肌中MYH7与ACTN1的表达 | 第67-68页 |
| 2.干扰FAT10加重AngII诱导的原代心肌细胞肥大表型 | 第68-71页 |
| 2.1 干扰FAT10可增加AngII诱导下的细胞表面积 | 第68-69页 |
| 2.2 干扰FAT10促进肥大心肌中ANF与BNP的合成 | 第69-70页 |
| 2.3 干扰FAT10促进肥大心肌中MYH7与ACTN1的表达 | 第70-71页 |
| 3.串联质谱预测并分析FAT10的相互作用蛋白 | 第71-72页 |
| 4.验证FAT10与CaMK2D的相互作用 | 第72-74页 |
| 4.1 免疫共沉淀证实心肌组织中FAT10与CaMK2D的相互作用 | 第72-73页 |
| 4.2 免疫荧光证实FAT10与CaMK2D在心肌细胞中共定位 | 第73-74页 |
| 5.FAT10影响了CaMK2D的mRNA与蛋白表达与功能 | 第74-79页 |
| 5.1 FAT10对CaMK2D表达的影响 | 第74-75页 |
| 5.2 FAT10对RyR2磷酸化的影响 | 第75-77页 |
| 5.3 干扰FAT10引起的表型依赖于CaMK2D的活性 | 第77-79页 |
| 6.心肌肥厚对FAT10与CaMK2D相互作用的影响 | 第79页 |
| 讨论 | 第79-82页 |
| 结论 | 第82-83页 |
| 第三章 FAT10与CaMK2D相互作用的机制研究 | 第83-121页 |
| 材料与方法 | 第83-106页 |
| 1.实验材料 | 第83页 |
| 2.主要实验设备及仪器 | 第83-84页 |
| 3.主要试剂及其配置 | 第84-89页 |
| 3.1 主要试剂 | 第84-86页 |
| 3.2 主要试剂配置 | 第86-89页 |
| 4.实验方法 | 第89-106页 |
| 4.1 HEK293细胞复苏 | 第89-90页 |
| 4.2 HEK293细胞传代 | 第90页 |
| 4.3 细胞冻存 | 第90-91页 |
| 4.4 HEK293细胞转染(质粒及干扰片段) | 第91页 |
| 4.5 乳鼠原代心肌细胞培养 | 第91-92页 |
| 4.6 构建Flag-FAT10与Flag-FAT10ΔGG重组质粒 | 第92-97页 |
| 4.6.1 FAT10序列的查找、载体选择与引物设计 | 第92-93页 |
| 4.6.2 FAT10 WT cDNA序列的合成 | 第93-94页 |
| 4.6.3 利用TAKARA公司的凝胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0回收DNA | 第94页 |
| 4.6.4 双酶切及连接反应 | 第94-95页 |
| 4.6.5 连接产物转化至DH5α菌株 | 第95页 |
| 4.6.6 质粒小提与鉴定 | 第95-96页 |
| 4.6.7 质粒的大量提取 | 第96-97页 |
| 4.7 构建His-CaMK2D与GST-CaMK2D质粒 | 第97-99页 |
| 4.8 CaMK2D分段克隆 | 第99页 |
| 4.9 细胞免疫共沉淀反应 | 第99-100页 |
| 4.10 GST-pulldown | 第100-101页 |
| 4.11 细胞总蛋白提取 | 第101页 |
| 4.12 蛋白浓度的测定 | 第101页 |
| 4.13 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳与转印 | 第101-102页 |
| 4.14 蛋白质印记抗体标记与显色 | 第102-103页 |
| 4.15 细胞总RNA提取 | 第103页 |
| 4.16 逆转录PCR | 第103-104页 |
| 4.17 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第104-105页 |
| 4.18 细胞免疫荧光 | 第105页 |
| 4.19 荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET) | 第105-106页 |
| 4.20 统计方法 | 第106页 |
| 结果 | 第106-117页 |
| 1.FAT10对CaMK2D蛋白表达的影响不依赖蛋白酶体 | 第106-108页 |
| 2.验证FAT10与CaMK2D的外源性相互作用 | 第108-109页 |
| 3.免疫共沉淀实验证明FAT10与CaMK2D的直接相互作用 | 第109-110页 |
| 4.FAT10影响CaMK2D分子构象 | 第110-112页 |
| 5.FAT10与CaMK2D的结合不依赖UBA6与UBE2Z | 第112-114页 |
| 6.FAT10与CaMK2D结合区域的鉴定 | 第114-117页 |
| 讨论 | 第117-120页 |
| 结论 | 第120-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 参考文献 | 第122-130页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第130-132页 |
| 综述 | 第132-139页 |
| 参考文献 | 第138-139页 |
