| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词表 | 第9-10页 |
| 1 前言 | 第10-21页 |
| 1.1 课题的提出 | 第10-11页 |
| 1.2 植物原生质体研究进展 | 第11-14页 |
| 1.2.1 植物原生质体特点 | 第11页 |
| 1.2.2 植物原生质体分离 | 第11-12页 |
| 1.2.3 植物原生质体转化方法 | 第12-13页 |
| 1.2.4 PEG介导的植物原生质体瞬时转化效率 | 第13-14页 |
| 1.2.5 植物原生质体瞬时转化的应用 | 第14页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9系统的发展与应用 | 第14-19页 |
| 1.3.1 基因组编辑技术概述 | 第14-16页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9系统的作用机制 | 第16-17页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9系统的优化与发展 | 第17-18页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用 | 第18-19页 |
| 1.4 柑橘CRISPR/Cas9系统的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.5 本实验研究的目的及内容 | 第20-21页 |
| 2 材料和方法 | 第21-30页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-22页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第21页 |
| 2.1.2 菌株与载体 | 第21页 |
| 2.1.3 主要试剂与酶 | 第21-22页 |
| 2.1.4 培养基与溶液配方 | 第22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-30页 |
| 2.2.1 载体构建方法 | 第22-28页 |
| 2.2.1.1 CRISPR/Cas9载体pRGE31-CsP5CS2 | 第22-26页 |
| 2.2.1.2 CRISPR/Cas9载体pKSE-GFP-CsP5CS2 | 第26-28页 |
| 2.2.1.3 亚细胞定位载体 | 第28页 |
| 2.2.2 柑橘原生质体提取与纯化 | 第28-29页 |
| 2.2.3 柑橘原生质体瞬时转化方法 | 第29页 |
| 2.2.4 根癌农杆菌介导的遗传转化法 | 第29页 |
| 2.2.5 柑橘U6启动子CsU6的扩增 | 第29-30页 |
| 3 结果与分析 | 第30-43页 |
| 3.1 原生质体提取与纯化步骤优化 | 第30-31页 |
| 3.2 原生质体瞬时转化效率的影响因素评价 | 第31-35页 |
| 3.2.1 原生质体材料来源 | 第31-32页 |
| 3.2.2 共转化处理方式 | 第32-35页 |
| 3.2.3 PEG溶液Ca~(2+)浓度 | 第35页 |
| 3.3 利用柑橘原生质体研究蛋白质的亚细胞定位 | 第35-37页 |
| 3.4 利用柑橘原生质体研究蛋白质互作-BiFC | 第37页 |
| 3.5 CRISPR/Cas9载体构建 | 第37-40页 |
| 3.5.1 利用tRNA-gRNA体系构建CsSPL基因单靶位点编辑载体 | 第37-38页 |
| 3.5.2 利用tRNA-gRNA体系构建CsP5CS2基因双靶位点编辑载体 | 第38页 |
| 3.5.3 构建pKSE-GFP-CsP5CS2编辑载体 | 第38-39页 |
| 3.5.4 构建Cas9/CsU6体系编辑载体 | 第39-40页 |
| 3.6 根癌农杆菌介导山金柑上胚轴的遗传转化 | 第40-43页 |
| 3.6.1 转基因过程 | 第40-41页 |
| 3.6.2 转基因阳性植株序列分析 | 第41-43页 |
| 4 讨论 | 第43-46页 |
| 4.1 柑橘原生质体瞬时转化体系比较 | 第43-44页 |
| 4.2 3种不同CRISPR/Cas9载体比较 | 第44页 |
| 4.3 柑橘愈伤组织原生质体瞬时转化效率低的可能原因 | 第44-46页 |
| 参考文献 | 第46-54页 |
| 附录 Ⅰ 培养基配方 | 第54-56页 |
| 附录 Ⅱ 溶液配方 | 第56-57页 |
| 附录 Ⅲ 柑橘原生质体瞬时转化方法二 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
