| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 文献综述 | 第15-35页 |
| 第一章 哺乳动物非病毒靶向性基因转移工具研究进展 | 第15-24页 |
| 1.1 外源质粒或蛋白导入细胞方式 | 第15-16页 |
| 1.2 非病毒靶向性载体在基因转移过程中的重要作用 | 第16-21页 |
| 1.2.1 Cre-loxP 系统介导的可逆性整合 | 第16-17页 |
| 1.2.2 PhiC31 系统介导的热点整合 | 第17-18页 |
| 1.2.3 新型基因组编辑技术介导的定点同源重组 | 第18-21页 |
| 1.3 真核靶向性载体的改进策略 | 第21-23页 |
| 1.3.1 引入绝缘子序列增强外源基因表达的稳定性 | 第21页 |
| 1.3.2 利用 Cre-loxP 系统移除筛选标记 | 第21页 |
| 1.3.3 引入内部核糖体进入位点(IRES)和自剪切多肽 2A 实现多基因共表达 | 第21-22页 |
| 1.3.4 外源合成 mRNA 代替辅助质粒功能 | 第22-23页 |
| 1.3.5 原核表达蛋白酶替代供体质粒 | 第23页 |
| 1.4 靶向性载体的应用前景 | 第23-24页 |
| 第二章 piggyBac 转座子研究进展 | 第24-35页 |
| 2.1 PB 转座子基本结构 | 第25页 |
| 2.2 PB 转座机制 | 第25-26页 |
| 2.3 PB 转座特性 | 第26-28页 |
| 2.4 PB 转座子的应用 | 第28-33页 |
| 2.4.1 基因转移工具 | 第28-31页 |
| 2.4.2 PB 转座子作为遗传分析工具 | 第31-32页 |
| 2.4.3 PB 转座系统与其他靶向性载体系统的比较 | 第32-33页 |
| 2.5 PB 转座子作为基因转移系统的改进策略及前景 | 第33-35页 |
| 实验研究 | 第35-102页 |
| 第三章 通用型 PB 转座系统质粒的构建及基本元件的功能鉴定 | 第35-54页 |
| 3.1 材料和试剂 | 第35-36页 |
| 3.1.1 材料 | 第35-36页 |
| 3.1.2 试剂 | 第36页 |
| 3.2 方法 | 第36-43页 |
| 3.2.1 PB 转座元件的合成 | 第36页 |
| 3.2.2 口蹄疫病毒 2A 自剪肽介导的 GFP/NEO 筛选报告基因表达框的构建及功能验证 | 第36-38页 |
| 3.2.3 Cre-loxP 系统功能的体外验证 | 第38页 |
| 3.2.4 PB 转座系统辅助质粒的构建 | 第38-40页 |
| 3.2.5 PB 转座子单质粒基因转移系统的构建 | 第40-41页 |
| 3.2.6 外源 PB 转座酶 mRNA 介导的 PB 转座系统建立 | 第41-43页 |
| 3.3 结果 | 第43-52页 |
| 3.3.1 PCR 电泳结果 | 第43页 |
| 3.3.2 二元 PB 转座系统质粒酶切鉴定结果 | 第43-45页 |
| 3.3.3 供体质粒中 2A 介导的筛选报告基因功能鉴定结果 | 第45-48页 |
| 3.3.4 利用 BM25.6 大肠杆菌鉴定 Cre-loxP 系统功能鉴定结果 | 第48-49页 |
| 3.3.5 PB 转座酶启动子筛选及 PB 转座系统单质粒鉴定结果 | 第49-51页 |
| 3.3.6 PB 转座酶 mRNA 鉴定结果 | 第51-52页 |
| 3.4 讨论 | 第52-53页 |
| 3.5 小结 | 第53-54页 |
| 第四章 三种 PB 转座系统的转座活性和转座酶活性鉴定 | 第54-65页 |
| 4.1 材料和试剂 | 第54页 |
| 4.2 方法 | 第54-57页 |
| 4.2.1 PB 双质粒系统和单质粒系统在 HEK 293 细胞中的转染和筛选 | 第54页 |
| 4.2.2 细胞克隆亚甲蓝染色 | 第54-55页 |
| 4.2.3 PB 双质粒系统和单质粒系统转座效率确认 | 第55页 |
| 4.2.4 PB 转座酶 mRNA 介导的转座效率确认 | 第55页 |
| 4.2.5 统计学分析 | 第55页 |
| 4.2.6 利用 Tail-PCR 检测 PB 转座整合位点 | 第55-57页 |
| 4.2.7 PB 转座酶活性分析 | 第57页 |
| 4.3 结果 | 第57-62页 |
| 4.3.1 PB 双质粒和单质粒转座系统的转染和转座效率确认结果 | 第57-59页 |
| 4.3.2 PB 转座酶 mRNA 介导的转座效率检测结果 | 第59页 |
| 4.3.3 三种 PB 转座系统在基因组中的整合位点检测结果 | 第59-61页 |
| 4.3.4 三种 PB 转座系统的转座酶活性分析 | 第61-62页 |
| 4.4 讨论 | 第62-64页 |
| 4.5 小结 | 第64-65页 |
| 第五章 PB 转座酶的原核表达及其在 HEK293 细胞中的功能验证 | 第65-75页 |
| 5.1 材料 | 第65-66页 |
| 5.1.1 菌株、质粒及主要试剂 | 第65-66页 |
| 5.1.2 引物设计与合成 | 第66页 |
| 5.2 方法 | 第66-68页 |
| 5.2.1 优化后的 PB 转座酶编码基因扩增 | 第66页 |
| 5.2.2 重组表达质粒的构建 | 第66-67页 |
| 5.2.3 重组蛋白的纯化和表达形式分析 | 第67页 |
| 5.2.4 纯化产物的 Western blot 鉴定 | 第67页 |
| 5.2.5 纯化 PBase 转导 HEK293 细胞 | 第67-68页 |
| 5.2.6 PB 转座整合位点检测 | 第68页 |
| 5.2.7 转座效率检测 | 第68页 |
| 5.3 结果 | 第68-73页 |
| 5.3.1 PB 转座酶编码区 PCR 产物鉴定 | 第68-69页 |
| 5.3.2 重组表达质粒图谱及其酶切鉴定 | 第69页 |
| 5.3.3 重组蛋白的纯化条件和纯化产物鉴定 | 第69-70页 |
| 5.3.4 Western blot 鉴定结果 | 第70页 |
| 5.3.5 PBase 转导 HEK293 鉴定结果 | 第70-71页 |
| 5.3.6 整合位点检测结果 | 第71-73页 |
| 5.3.7 细胞克隆数统计结果 | 第73页 |
| 5.4 讨论 | 第73-74页 |
| 5.5 小结 | 第74-75页 |
| 第六章 PB 转座子单质粒系统介导生产转人乳铁蛋白和溶菌酶双基因牛皮肤成纤维细胞 | 第75-90页 |
| 6.1 材料和试剂 | 第75-76页 |
| 6.1.1 材料 | 第75页 |
| 6.1.2 试剂 | 第75-76页 |
| 6.2 方法 | 第76-81页 |
| 6.2.1 PB 转座单质粒系统介导的人溶菌酶和乳铁蛋白双基因乳腺特异性表达的载体构建 | 第76-78页 |
| 6.2.2 牛耳朵成纤维和乳腺上皮细胞的分离培养、转染和筛选 | 第78-79页 |
| 6.2.3 细胞克隆的相关检测 | 第79-80页 |
| 6.2.4 利用体细胞核移植技术生产转基因克隆胚胎 | 第80-81页 |
| 6.3 结果 | 第81-88页 |
| 6.3.1 PCR 扩增 DNA 片段琼脂糖凝胶电泳结果 | 第81页 |
| 6.3.2 质粒酶切鉴定结果 | 第81-83页 |
| 6.3.3 牛成纤维细胞单克隆筛选及鉴定结果 | 第83-86页 |
| 6.3.4 牛转基因克隆胚胎体外发育情况 | 第86-87页 |
| 6.3.5 牛β酪蛋白启动子在乳腺细胞中的验证结果 | 第87-88页 |
| 6.4 讨论 | 第88-89页 |
| 6.5 小结 | 第89-90页 |
| 第七章 PB 转座酶 mRNA 结合 Cre-loxP 系统生产无筛选报告基因牛乳腺上皮细胞 | 第90-102页 |
| 7.1 材料和试剂 | 第90页 |
| 7.2 方法 | 第90-93页 |
| 7.2.1 利用 PB 转座酶制备转人乳铁蛋白基因的牛乳腺上皮细胞 | 第90-91页 |
| 7.2.2 转基因牛乳腺上皮细胞 PCR 初步鉴定 | 第91-92页 |
| 7.2.3 TAT-Cre 重组酶的原核表达纯化 | 第92页 |
| 7.2.4 无筛选标记牛转基因乳腺细胞获取和鉴定 | 第92-93页 |
| 7.2.5 体细胞核移植及克隆胚胎鉴定 | 第93页 |
| 7.3 结果 | 第93-99页 |
| 7.3.1 转人 LTF 牛乳腺细胞鉴定结果 | 第93-95页 |
| 7.3.2 TAT-Cre 重组酶鉴定结果 | 第95-96页 |
| 7.3.3 无筛选标记牛乳腺细胞初步鉴定 | 第96-97页 |
| 7.3.4 转基因克隆胚胎体外发育状况评估 | 第97-99页 |
| 7.4 讨论 | 第99-101页 |
| 7.5 小结 | 第101-102页 |
| 全文结论 | 第102-103页 |
| 创新之处和进一步研究的课题 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-119页 |
| 附录 | 第119-134页 |
| 缩略词 | 第134-136页 |
| 致谢 | 第136-137页 |
| 个人简介 | 第137-138页 |
