| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8页 |
| 目录 | 第9-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-23页 |
| 1.1 链霉菌次级代谢合成机制的研究进展 | 第12-15页 |
| 1.1.1 非核糖体肽合成酶(NRPS) | 第12-13页 |
| 1.1.2 聚酮合酶 | 第13-15页 |
| 1.1.3 酰基转移酶 | 第15页 |
| 1.2 链霉菌次级代谢调控 | 第15-20页 |
| 1.2.1 全局性调控 | 第15-17页 |
| 1.2.2 多效性调控 | 第17-18页 |
| 1.2.2.1 双组分信号传导系统 | 第17页 |
| 1.2.2.2 Sigma因子 | 第17-18页 |
| 1.2.3 途径特异性调控 | 第18-20页 |
| 1.2.3.1 SARP家族蛋白 | 第18页 |
| 1.2.3.2 AsnC家族蛋白 | 第18-19页 |
| 1.2.3.3 LysR家族蛋白 | 第19页 |
| 1.2.3.4 LAL家族 | 第19-20页 |
| 1.3 FK506合成与调控机制的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.3.1 FK506的作用机制 | 第20页 |
| 1.3.2 FK506的合成途径 | 第20-21页 |
| 1.3.3 FK506的调控机制 | 第21-22页 |
| 1.4 本课题的研究内容 | 第22-23页 |
| 第二章 酰基转移酶的底物选择性 | 第23-35页 |
| 2.1 材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第23页 |
| 2.1.2 实验仪器和设备 | 第23-24页 |
| 2.1.3 培养基 | 第24页 |
| 2.1.4 主要试剂和溶液 | 第24页 |
| 2.1.5 酶和生化试剂 | 第24-25页 |
| 2.2 方法 | 第25-28页 |
| 2.2.1 PCR扩增基因 | 第25页 |
| 2.2.2 核酸片段割胶回收 | 第25页 |
| 2.2.3 加A尾及与pTA2载体的连接反应 | 第25页 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第26页 |
| 2.2.6 大肠杆菌质粒抽提 | 第26页 |
| 2.2.7 质粒酶切 | 第26-27页 |
| 2.2.8 大肠杆菌中重组蛋白表达 | 第27页 |
| 2.2.9 蛋白纯化 | 第27页 |
| 2.2.10 酰基-O-AT的获得 | 第27页 |
| 2.2.11 全辅基化ACP(holo-ACP)的生化合成 | 第27-28页 |
| 2.2.12 酰基-S-ACP的获得 | 第28页 |
| 2.2.13 蛋白的LC-MS分析 | 第28页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第28-34页 |
| 2.3.1 在大肠杆菌中表达AT10_(FkbA)、ACP10_(FkbA)、ACP2_(FkbB)和蛋白纯化 | 第28-29页 |
| 2.3.2 AT10_(FkbA)的自酰基化 | 第29-31页 |
| 2.3.3 AT10_(FkbA)催化的转酰基化 | 第31-33页 |
| 2.3.4 AT10_(FkbA)催化的转酰基化反应中对ACP底物的选择性 | 第33-34页 |
| 2.4 小结 | 第34-35页 |
| 第三章 FK506合成的途径特异性调控 | 第35-54页 |
| 3.1 试验材料 | 第35-37页 |
| 3.1.1 大肠杆菌菌株和质粒 | 第35-36页 |
| 3.1.2 实验仪器和设备 | 第36页 |
| 3.1.3 培养基 | 第36-37页 |
| 3.1.4 主要试剂和溶液 | 第37页 |
| 3.2 方法 | 第37-42页 |
| 3.2.1 大肠杆菌Fosmid抽提 | 第37-38页 |
| 3.2.2 链霉菌基因组提取 | 第38页 |
| 3.2.3 E.coli-链霉菌接合转导 | 第38页 |
| 3.2.4 凝胶阻滞电泳 | 第38-39页 |
| 3.2.5 FK506检测方法 | 第39页 |
| 3.2.6 PCR-targeting法敲除 | 第39-42页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第42-53页 |
| 3.3.1 筑波链霉菌培养、发酵及检测条件的摸索 | 第42-45页 |
| 3.3.2 途径特异性调控 | 第45-50页 |
| 3.3.2.1 敲除株载体的构建 | 第45-49页 |
| 3.3.2.2 过表达株的构建 | 第49-50页 |
| 3.3.3 体外实验 | 第50-53页 |
| 3.4 小结 | 第53-54页 |
| 第四章 总结与展望 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-60页 |
| 攻读硕士学位期间主要研究成果 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
