| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 文献综述 | 第12-22页 |
| 第一章 基因编辑技术研究概况 | 第12-18页 |
| 1.1 锌指酶ZFN研究概述 | 第12页 |
| 1.2 转录激活因子样效应因子核酸酶TALENs研究概述 | 第12-13页 |
| 1.3 规律成簇间隔短回文重复CRISPR/Cas9系统研究概述 | 第13-18页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9系统概述 | 第13-16页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9基因修饰动物的应用前景 | 第16-18页 |
| 第二章 BMP9研究概况 | 第18-22页 |
| 2.1 BMP9家族成员及其结构 | 第18页 |
| 2.2 BMP9参与的信号调控机制 | 第18-20页 |
| 2.3 BMP9的生物学功能 | 第20-21页 |
| 2.4 本研究的意义 | 第21-22页 |
| 试验研究 | 第22-56页 |
| 第三章 bmp9 sg RNA筛选及体外转录方案的优化 | 第22-39页 |
| 3.1 材料 | 第22-23页 |
| 3.1.1 质粒、细胞和抗体 | 第22页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 | 第22-23页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第23页 |
| 3.2 方法 | 第23-33页 |
| 3.2.1 bmp9敲除设计方案 | 第23页 |
| 3.2.2 引物序列 | 第23-24页 |
| 3.2.3 酶切慢病毒载体质粒 | 第24页 |
| 3.2.4 慢病毒载体的构建与包装 | 第24-25页 |
| 3.2.5 慢病毒的滴度测定 | 第25-26页 |
| 3.2.6 嘌呤霉素最适浓度的确定 | 第26-27页 |
| 3.2.7 稳转阳性细胞的筛选 | 第27页 |
| 3.2.8 慢病毒感染后细胞形态变化及活性检测 | 第27页 |
| 3.2.9 Western Blotting检测 | 第27-29页 |
| 3.2.10 细胞基因组测序鉴定 | 第29-31页 |
| 3.2.11 sg RNA的合成转录方法优化 | 第31-33页 |
| 3.3 结果与分析 | 第33-38页 |
| 3.3.1 bmp9基因敲除靶点的确定 | 第33-34页 |
| 3.3.2 酶切鉴定慢病毒质粒连接产物 | 第34-35页 |
| 3.3.3 慢病毒滴度测定 | 第35页 |
| 3.3.4 慢病毒感染细胞形态及活力变化 | 第35-36页 |
| 3.3.5 Western blotting检测阳性克隆细胞中BMP9表达量 | 第36页 |
| 3.3.6 基因组测序结果 | 第36-37页 |
| 3.3.7 sg RNA优化转录结果 | 第37-38页 |
| 3.8 讨论 | 第38页 |
| 3.9 本章小结 | 第38-39页 |
| 第四章 C57BL/6 型小鼠超数排卵方案优化 | 第39-44页 |
| 4.1 材料 | 第39页 |
| 4.1.1 实验动物 | 第39页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第39页 |
| 4.1.3 主要仪器设备 | 第39页 |
| 4.2 方法 | 第39-40页 |
| 4.2.1 试剂的配制和保存 | 第39-40页 |
| 4.2.2 小鼠周龄对照试验 | 第40页 |
| 4.2.3 激素使用量对照试验 | 第40页 |
| 4.2.4 PMSG和h CG注射间隔时间对照试验 | 第40页 |
| 4.2.5 供体C57BL/6 小鼠受精卵细胞的收集 | 第40页 |
| 4.2.6 统计学分析 | 第40页 |
| 4.3 结果 | 第40-42页 |
| 4.3.1 小鼠周龄对超排效果影响 | 第40-41页 |
| 4.3.2 激素注射量对超排效果影响 | 第41页 |
| 4.3.4 两激素注射间隔时间对超排效果影响 | 第41-42页 |
| 4.4 讨论 | 第42页 |
| 4.5 本章小结 | 第42-44页 |
| 第五章 基于CRISPR/Cas9技术建立bmp9基因敲除小鼠模型 | 第44-56页 |
| 5.1 材料 | 第44-45页 |
| 5.1.1 实验动物 | 第44页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第44-45页 |
| 5.1.3 抗体和引物序列 | 第45页 |
| 5.1.4 主要仪器设备 | 第45页 |
| 5.2 方法 | 第45-50页 |
| 5.2.1 主要试剂的配置和保存 | 第45页 |
| 5.2.2 sg RNA的合成转录方法优化 | 第45页 |
| 5.2.3 sg RNA的效率验证 | 第45-46页 |
| 5.2.4 C57BL/6 供体雌鼠的准备 | 第46页 |
| 5.2.5 供体C57BL/6 小鼠受精卵细胞的收集 | 第46页 |
| 5.2.6 显微注射sg RNA和Cas9 m RNA混合物 | 第46页 |
| 5.2.7 受体ICR雌鼠的假孕准备 | 第46-47页 |
| 5.2.8 胚胎移植 | 第47页 |
| 5.2.9 F0代敲除鼠的基因型鉴定与靶位点突变分析 | 第47-48页 |
| 5.2.10 回交育种得到纯合bmp9敲除小鼠 | 第48页 |
| 5.2.11 纯合bmp9敲除鼠组织蛋白水平检测 | 第48-49页 |
| 5.2.12 纯合bmp9敲除鼠疫组化检测 | 第49-50页 |
| 5.3 结果 | 第50-55页 |
| 5.3.1 bmp9 sg RNA的合成转录与鉴定 | 第50-51页 |
| 5.3.2 bmp9 sg RNA的体外切割效率 | 第51页 |
| 5.3.3bmp9基因敲除鼠基因型鉴定结果 | 第51-53页 |
| 5.3.4 bmp9基因敲除鼠组织Western Blotting检测结果 | 第53页 |
| 5.3.6 纯合敲除鼠肝组织免疫组化结果 | 第53-55页 |
| 5.4 讨论 | 第55页 |
| 5.5 本章小结 | 第55-56页 |
| 全文结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-65页 |
| 英文缩略词和中英文对照表 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 作者简介 | 第67页 |
