| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-46页 |
| 1 microRNA的发现及生物合成机制 | 第17-23页 |
| 1.1 microRNA的发现 | 第17-18页 |
| 1.2 microRNA的生物合成机制 | 第18-21页 |
| 1.2.1 植物miRNA的转录 | 第20页 |
| 1.2.2 植物miRNA的加工运输 | 第20页 |
| 1.2.3 植物miRNA功能沉默复合体的装配 | 第20-21页 |
| 1.3 microRNA的作用机制 | 第21页 |
| 1.4 microRNA与siRNA的关系 | 第21-23页 |
| 1.5 植物miRNA的特点 | 第23页 |
| 2 鉴定植物microRNA的方法 | 第23-27页 |
| 2.1 组织特异性克隆 | 第24-25页 |
| 2.2 生物信息学克隆和实验鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3 反转录聚合酶链式反应 | 第26页 |
| 2.4 正反向遗传克隆 | 第26-27页 |
| 3 microRNA数据库 | 第27-30页 |
| 4 microRNA的功能 | 第30-35页 |
| 4.1 植物逆境胁迫响应miRNA | 第30-33页 |
| 4.1.1 植物miRNA与生物胁迫 | 第30页 |
| 4.1.2 植物miRNA与非生物胁迫 | 第30-33页 |
| 4.1.2.1 miRNA与植物养分胁迫 | 第31-32页 |
| 4.1.2.1.1 miRNA与低氮胁迫 | 第31页 |
| 4.1.2.1.2 miRNA与低磷胁迫 | 第31-32页 |
| 4.1.2.1.3 miRNA与缺硫胁迫 | 第32页 |
| 4.1.2.1.4 miRNA与微量元素 | 第32页 |
| 4.1.2.2 miRNA与低温胁迫 | 第32页 |
| 4.1.2.3 miRNA与干旱胁迫 | 第32-33页 |
| 4.1.2.4 miRNA与高盐胁迫 | 第33页 |
| 4.2 植物miRNA对植物生长发育的影响 | 第33-35页 |
| 4.2.1 对根发育的影响 | 第34页 |
| 4.2.2 对叶和茎发育的影响 | 第34页 |
| 4.2.3 对花发育的影响 | 第34-35页 |
| 5 miRNA及其靶基因在作物遗传改良上的应用 | 第35页 |
| 6 木薯 | 第35-38页 |
| 6.1 木薯的基本特性 | 第36-37页 |
| 6.2 木薯的用途和经济价值 | 第37-38页 |
| 6.2.1 木薯的营养成分 | 第37页 |
| 6.2.2 木薯的加工利用 | 第37-38页 |
| 7 木薯再生体系建立和转基因方法综述 | 第38-43页 |
| 7.1 木薯再生体系建立 | 第38-41页 |
| 7.1.1 木薯组织培养过程中器官发生途径 | 第38-39页 |
| 7.1.1.1 直接器官发生途径 | 第38-39页 |
| 7.1.1.2 间接器官发生途径 | 第39页 |
| 7.1.2 体细胞胚胎发生途径 | 第39-41页 |
| 7.1.2.1 木薯初级胚状体发生 | 第39-40页 |
| 7.1.2.2 木薯次级体胚发生 | 第40页 |
| 7.1.2.3 脆性胚性愈伤及其悬浮培养 | 第40-41页 |
| 7.2 木薯遗传转化方法的研究进展 | 第41-43页 |
| 7.2.1 基因枪转化法 | 第41页 |
| 7.2.2 农杆菌介导法 | 第41-42页 |
| 7.2.2.1 农杆菌转化机理 | 第41-42页 |
| 7.2.2.2 农杆菌转化的优点 | 第42页 |
| 7.2.3 转基因木薯的研究进展 | 第42-43页 |
| 8 木薯转基因育种研究 | 第43-44页 |
| 8.1 抗逆方面 | 第43页 |
| 8.1.1 抗病毒转基因育种 | 第43页 |
| 8.1.2 抗除草剂基因育种 | 第43页 |
| 8.2 品质改良方面 | 第43-44页 |
| 8.2.1 提高蛋白质含量 | 第43-44页 |
| 8.2.2 降低氰化物含量 | 第44页 |
| 9 本研究的目的和意义 | 第44-46页 |
| 第二章 拟南芥miRNAs分离及表达载体构建 | 第46-57页 |
| 1 材料 | 第46-47页 |
| 1.1 植物材料 | 第46页 |
| 1.2 菌株与质粒 | 第46页 |
| 1.3 工具酶及试剂盒 | 第46页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第46页 |
| 1.5 培养基配制 | 第46-47页 |
| 2 方法 | 第47-53页 |
| 2.1 CTAB法提取拟南芥DNA | 第47页 |
| 2.2 引物设计 | 第47-48页 |
| 2.3 PCR反应 | 第48页 |
| 2.4 目的片段的回收 | 第48-49页 |
| 2.5 目的片段和质粒的酶切、连接 | 第49-50页 |
| 2.5.1 酶切 | 第49页 |
| 2.5.2 连接 | 第49-50页 |
| 2.6 宿主菌E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第50页 |
| 2.7 连接产物转化大肠杆菌 | 第50页 |
| 2.8 碱裂解法提取重组质粒 | 第50-51页 |
| 2.9 重组子的PCR及酶切鉴定 | 第51页 |
| 2.10 植物表达载体的构建方案 | 第51-53页 |
| 2.10.1 pVKH-35S-miR172c-pA植物表达载体构建 | 第51-52页 |
| 2.10.2 pVKH-35S-miR319+402+393-pA植物表达载体构建 | 第52-53页 |
| 2.11 两种植物表达载体转化农杆菌LBA4404 | 第53页 |
| 2.11.1 农杆菌感受态的制备 | 第53页 |
| 2.11.2 质粒载体转化农杆菌 | 第53页 |
| 2.11.3 阳性克隆筛选与鉴定 | 第53页 |
| 3. 结果分析 | 第53-55页 |
| 3.1 miRNA前体克隆与序列比对 | 第53-54页 |
| 3.2 构建的表达载体鉴定 | 第54-55页 |
| 3.3 植物表达载体导入农杆菌中的鉴定 | 第55页 |
| 4. 讨论 | 第55-57页 |
| 第三章 miR172c、miR319c、miR393b、miR402功能鉴定及其靶基因的生物信息学预测 | 第57-80页 |
| 1 材料 | 第57页 |
| 1.1 植物材料 | 第57页 |
| 1.2 菌株与质粒 | 第57页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第57页 |
| 1.4 培养基配制 | 第57页 |
| 2 实验方法 | 第57-64页 |
| 2.1 miR172c、miR319c、miR393b、miR402靶基因的生物信息学预测 | 第57-58页 |
| 2.2 拟南芥培养及其管理 | 第58-59页 |
| 2.2.1 无菌培养基培养 | 第58页 |
| 2.2.2 拟南芥盆栽培养 | 第58页 |
| 2.2.3 拟南芥苗期管理 | 第58-59页 |
| 2.3 农杆菌真空转化菌液制备 | 第59页 |
| 2.4 真空渗入法转化拟南芥 | 第59页 |
| 2.5 T1代拟南芥抗性筛选及抗性苗移栽 | 第59-60页 |
| 2.6 拟南芥阳性转化体PCR鉴定 | 第60页 |
| 2.7 拟南芥T1代种子抗性分离比测定 | 第60页 |
| 2.8 半定量RT-PCR方法检测四种miRNA在野生和转基因拟南芥中的表达量 | 第60-63页 |
| 2.8.1 引物设计 | 第60-61页 |
| 2.8.2 总RNA提取 | 第61-62页 |
| 2.8.3. RT-PCR检测miRNA的表达量 | 第62-63页 |
| 2.8.3.1 反转录 | 第62-63页 |
| 2.8.3.2 PCR反应 | 第63页 |
| 2.9 miR172高表达转基因拟南芥表型变化分析 | 第63页 |
| 2.10 miR319、393、402高表达转基因拟南芥表型变化分析 | 第63页 |
| 2.11 miR319、393、402高表达转基因拟南芥的抗寒性分析 | 第63-64页 |
| 3 结果与分析 | 第64-78页 |
| 3.1 转基因拟南芥植株的获得 | 第64-66页 |
| 3.1.1 转基因阳性植株的获得 | 第64页 |
| 3.1.2 T1代拟南芥阳性转化体的PCR鉴定 | 第64-65页 |
| 3.1.3 T1代种子抗性分离比测定 | 第65-66页 |
| 3.2 半定量RT-PCR方法检测四种miRNA在野生和转基因拟南芥中的表达量 | 第66-67页 |
| 3.2.1 RT-PCR检测mi172的表达量 | 第66页 |
| 3.2.2 RT-PCR检测mi319、393、402的表达量 | 第66-67页 |
| 3.3 172转基因拟南芥生长发育的变化 | 第67-70页 |
| 3.3.1 转基因拟南芥表型变化 | 第67页 |
| 3.3.2 转基因拟南芥花期的变化 | 第67-68页 |
| 3.3.3 miR172高表达转基因拟南芥的根长比较 | 第68页 |
| 3.3.4 产量比较 | 第68-69页 |
| 3.3.5 对比野生型与转基因拟南芥的生殖器官发育 | 第69-70页 |
| 3.4 miR319、393、402高表达转基因拟南芥生长发育的变化 | 第70-72页 |
| 3.4.1 转基因拟南芥表型变化 | 第70-71页 |
| 3.4.2 转基因拟南芥的根长比较 | 第71页 |
| 3.4.3 果荚和种子发育变化 | 第71-72页 |
| 3.5 抗寒实验 | 第72页 |
| 3.6 目标基因的预测 | 第72-78页 |
| 3.6.1 miR172c目标基因的预测 | 第73-75页 |
| 3.6.2 miR319c目标基因的预测 | 第75-76页 |
| 3.6.3 miR393b目标基因的预测 | 第76-78页 |
| 3.6.4 miR402目标基因的预测 | 第78页 |
| 4 讨论 | 第78-80页 |
| 4.1 miRNA靶基因的生物信息学预测 | 第78页 |
| 4.2 miR319、393、402对拟南芥抗寒性的影响 | 第78-79页 |
| 4.3 miR172过量表达对拟南芥生长发育的影响 | 第79页 |
| 4.4 miR319、393、402过量表达对拟南芥生长发育的影响 | 第79-80页 |
| 第四章 miR319c、miR393b、miR402融合转化木薯的研究 | 第80-93页 |
| 1. 材料 | 第80页 |
| 1.1 植物材料 | 第80页 |
| 1.2 植物激素和抗生素 | 第80页 |
| 1.3 植物培养基 | 第80页 |
| 2 方法 | 第80-85页 |
| 2.1 无菌苗的获得和再生体系的建立 | 第80-81页 |
| 2.1.1 实生苗的消毒 | 第80-81页 |
| 2.1.2 再生体系的建立 | 第81页 |
| 2.2 木薯子叶胚受体系统建立 | 第81-82页 |
| 2.2.1 建立过程 | 第81页 |
| 2.2.2 膨大腋芽的获得 | 第81页 |
| 2.2.3 初级体细胞胚的诱导 | 第81-82页 |
| 2.2.4 木薯胚状体的成熟 | 第82页 |
| 2.2.5 木薯子叶胚茎器官发生 | 第82页 |
| 2.2.5.1 6-BA对木薯子叶胚茎器官发生的影响 | 第82页 |
| 2.2.5.2 抗菌素羧苄青霉素Car浓度的确定 | 第82页 |
| 2.3 农杆菌介导的子叶胚转化法 | 第82-83页 |
| 2.3.1 外植体的获得 | 第82页 |
| 2.3.2 侵染菌液获得 | 第82-83页 |
| 2.3.3 共培养时间 | 第83页 |
| 2.3.4 农杆菌的清洗 | 第83页 |
| 2.3.5 潮霉素筛选 | 第83页 |
| 2.3.6 抗性苗的获得 | 第83页 |
| 2.4 转基因植物PCR分子序列检测的方法 | 第83-85页 |
| 2.4.1 植物总DNA的提取(CTAB法) | 第83-84页 |
| 2.4.2 PCR检测 | 第84页 |
| 2.4.3 目的片段的回收 | 第84页 |
| 2.4.4 目的片段连接T-Vector | 第84页 |
| 2.4.5 连接产物的转化 | 第84-85页 |
| 2.4.6 送样测序 | 第85页 |
| 3 结果与分析 | 第85-91页 |
| 3.1 体细胞胚的诱导 | 第85-86页 |
| 3.1.1 毒莠定对体细胞胚胎发生的影响 | 第85页 |
| 3.1.2 次级胚状体的发生 | 第85-86页 |
| 3.2 不同6-BA浓度对胚状体成熟的影响 | 第86页 |
| 3.3 木薯子叶胚茎器官发生 | 第86页 |
| 3.4 木薯子叶胚茎伸长培养基的确定 | 第86页 |
| 3.5 农杆菌介导的转化的结果分析 | 第86-87页 |
| 3.6 抗菌素羧苄青霉素浓度 | 第87页 |
| 3.7 筛选压实验 | 第87-88页 |
| 3.8 抗性苗的获得 | 第88-89页 |
| 3.9 转基因植株的PCR序列检测结果分析 | 第89-91页 |
| 4 讨论 | 第91-93页 |
| 4.1 胚状体诱导 | 第91-92页 |
| 4.2 木薯遗传转化中的影响因素 | 第92页 |
| 4.3 抗寒转基因木薯的发展前景 | 第92-93页 |
| 第五章 木薯中miR172、miR319、miR393、miR402的RT-PCR鉴定及前体的克隆与结构分析 | 第93-119页 |
| 1 材料 | 第93页 |
| 1.1 植物材料 | 第93页 |
| 1.2 试剂 | 第93页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第93页 |
| 2 方法 | 第93-96页 |
| 2.1 木薯miR172、319、393、402的RT-PCR鉴定 | 第93-94页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第93页 |
| 2.1.2 木薯总RNA的提取 | 第93页 |
| 2.1.3 RT-PCR鉴定 | 第93-94页 |
| 2.1.3.1 反转录 | 第93页 |
| 2.1.3.2 PCR反应 | 第93-94页 |
| 2.2 木薯miR172、319、393、402前体的克隆、测序和结构分析 | 第94-96页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第94页 |
| 2.2.2 CTAB法提取木薯总DNA | 第94页 |
| 2.2.3 克隆和测序 | 第94-95页 |
| 2.2.4 目的片段的回收 | 第95页 |
| 2.2.5 连接产物的转化 | 第95页 |
| 2.2.5.1 目的片段和T-Vector的连接 | 第95页 |
| 2.2.5.2 连接产物的转化 | 第95页 |
| 2.2.5.3 送样测序 | 第95页 |
| 2.2.6 miRNA前体二级结构折叠及成熟序列预测 | 第95页 |
| 2.2.7 miRNA同源性分析 | 第95-96页 |
| 3 结果与分析 | 第96-117页 |
| 3.1 木薯miR172、miR319、miR393、miR402表达的RT-PCR鉴定 | 第96页 |
| 3.1.1 总RNA提取 | 第96页 |
| 3.1.2 RT-PCR鉴定 | 第96页 |
| 3.2 木薯miR172、319、393、402前体克隆及测序 | 第96-98页 |
| 3.3 木薯miR172、319、393、402前体二级结构及成熟序列 | 第98-109页 |
| 3.3.1 木薯miR172前体二级结构及成熟序列 | 第98-100页 |
| 3.3.2 木薯miR319前体二级结构及成熟序列 | 第100-107页 |
| 3.3.3 木薯miR393前体二级结构及成熟序列 | 第107-108页 |
| 3.3.4 木薯miR402前体二级结构及成熟序列 | 第108-109页 |
| 3.4 同源分析 | 第109-117页 |
| 3.4.1 木薯miR172与其它物种同源分析 | 第109-112页 |
| 3.4.2 木薯miR319与其它物种同源分析 | 第112-115页 |
| 3.4.3 木薯miR393与其它物种同源分析 | 第115-116页 |
| 3.4.4 木薯miR402与其它物种同源分析 | 第116-117页 |
| 3 讨论 | 第117-119页 |
| 第六章 研究结论 | 第119-120页 |
| 参考文献 | 第120-129页 |
| 致谢 | 第129页 |
