| 致谢 | 第7-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 主要缩略词 | 第13-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-51页 |
| 1.1 DNA以及DNA损伤 | 第20-22页 |
| 1.2 DNA的修复以及TLS | 第22-23页 |
| 1.3 DNA聚合酶 | 第23-33页 |
| 1.3.1 复制型的DNA聚合酶 | 第24-26页 |
| 1.3.2 低保真DNA聚合酶以及Y家族DNA聚合酶 | 第26-28页 |
| 1.3.3 人类DNA聚合酶η | 第28-33页 |
| 1.3.3.1 保真性以及错配延伸的能力 | 第28-29页 |
| 1.3.3.2 DNA聚合酶η结构的研究 | 第29-30页 |
| 1.3.3.3 人类DNA聚合酶的跨CPDs损伤合成 | 第30-31页 |
| 1.3.3.4 人类DNA聚合酶的跨Pt-GG损伤合成 | 第31-32页 |
| 1.3.3.5 人类DNA聚合酶参与体细胞超突变 | 第32-33页 |
| 1.4 X射线衍射技术 | 第33-36页 |
| 1.4.1 大分子结晶 | 第33-34页 |
| 1.4.2 DNA聚合酶三元复合物的结晶 | 第34-35页 |
| 1.4.3 晶体Seeding生长 | 第35-36页 |
| 1.5 本文的理论依据和研究意义 | 第36-38页 |
| 参考文献 | 第38-51页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第51-72页 |
| 2.1 实验材料 | 第51-61页 |
| 2.1.1 化学试剂 | 第51页 |
| 2.1.2 酶,菌株,标准品以及试剂盒 | 第51-52页 |
| 2.1.2.1 酶 | 第51页 |
| 2.1.2.2 菌株 | 第51-52页 |
| 2.1.2.3 DNA以及蛋白质标准品 | 第52页 |
| 2.1.2.4 试剂盒 | 第52页 |
| 2.1.3 色谱柱 | 第52-53页 |
| 2.1.4 晶体筛选试剂盒 | 第53页 |
| 2.1.5 仪器及设备 | 第53-54页 |
| 2.1.6 基因,引物以及寡聚核苷酸 | 第54-61页 |
| 2.1.6.1 人类DNA聚合酶η | 第54-55页 |
| 2.1.6.2 用于点突变的引物DNA | 第55-56页 |
| 2.1.6.3 起始筛选的寡聚核苷酸序列 | 第56-58页 |
| 2.1.6.4 用于最终结晶的寡聚核苷酸序列 | 第58-60页 |
| 2.1.6.5 用于酶动力学的寡聚核苷酸序列 | 第60-61页 |
| 2.1.6.6 用于生化活性鉴定的寡聚核苷酸序列 | 第61页 |
| 2.2 实验方法 | 第61-70页 |
| 2.2.1 顺铂交联DNA的制备 | 第61-62页 |
| 2.2.2 分子生物学实验 | 第62-66页 |
| 2.2.2.1 引物设计及PCR反应 | 第62-63页 |
| 2.2.2.2 连接反应 | 第63页 |
| 2.2.2.3 质粒转化 | 第63-64页 |
| 2.2.2.4 点突变PCR及产物转化 | 第64页 |
| 2.2.2.5 蛋白质的诱导表达及纯化 | 第64-66页 |
| 2.2.3 酶动力学以及引物延伸实验 | 第66页 |
| 2.2.4 结构生物学实验 | 第66-70页 |
| 2.2.4.1 DNA以及点突变蛋白的高通量筛选 | 第66页 |
| 2.2.4.2 蛋白质-DNA-脱氧核糖核苷酸三元复合物 | 第66页 |
| 2.2.4.3 蛋白质-DNA-脱氧核糖核苷酸三元复合物结晶条件的优化 | 第66-67页 |
| 2.2.4.4 相位的测定 | 第67-68页 |
| 2.2.4.5 晶体的衍射以及结构的解析 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-72页 |
| 第三章 纯化,三元复合物的制备及生化活性初步分析 | 第72-91页 |
| 3.1 DNA的制备及纯化 | 第72-73页 |
| 3.1.1 非损伤DNA的纯化 | 第72页 |
| 3.1.2 顺铂交联DNA的纯化 | 第72-73页 |
| 3.2 人类DNA聚合酶η的制备及纯化 | 第73-87页 |
| 3.2.1 人类DNA聚合酶η蛋白表达条件的摸索 | 第73-74页 |
| 3.2.2 人类DNA聚合酶η蛋白可溶性测试 | 第74-76页 |
| 3.2.3 人类DNA聚合酶η蛋白的纯化 | 第76-79页 |
| 3.2.4 人类DNA聚合酶η蛋白与DNA的理想配比 | 第79-81页 |
| 3.2.5 人类DNA聚合酶η蛋白的生化活性初步分析 | 第81-87页 |
| 3.2.5.1 引物延伸实验 | 第81-82页 |
| 3.2.5.2 碱基错误插入实验 | 第82页 |
| 3.2.5.3 反应体系盐浓度,pH以优化以及还原剂的选择 | 第82-85页 |
| 3.2.5.4 金属离子的选择 | 第85-86页 |
| 3.2.5.5 最终的反应体系 | 第86页 |
| 3.2.5.6 下游核苷酸序列效应 | 第86-87页 |
| 3.3 本章讨论 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-91页 |
| 第四章 晶体制备及结构解析 | 第91-104页 |
| 4.1 晶体的制备 | 第91-99页 |
| 4.1.1 初始的DNA筛选 | 第91-93页 |
| 4.1.2 Ⅰ型晶体的生长 | 第93页 |
| 4.1.3 Ⅰ型晶体结构解析以及晶体堆积 | 第93-96页 |
| 4.1.4 Ⅱ型晶体的生长 | 第96-97页 |
| 4.1.5 Ⅱ型晶体结构解析以及晶体堆积 | 第97-98页 |
| 4.1.6 Ⅲ型晶体的生长 | 第98-99页 |
| 4.2 相位的测定及结构的解析 | 第99-101页 |
| 4.2.1 分子置换法 | 第99-100页 |
| 4.2.2 MAD (Multiwavelenth anomalous diffraction) | 第100-101页 |
| 4.3 本章讨论 | 第101-103页 |
| 参考文献 | 第103-104页 |
| 第五章 嘧啶二聚体的跨损伤合成 | 第104-117页 |
| 5.1 人类DNA聚合酶η与非损伤DNA共结晶 | 第104-107页 |
| 5.1.1 人类DNA聚合酶η的结构特征 | 第104-107页 |
| 5.2 人类DNA聚合酶η与嘧啶二聚体DNA(CPD)共结晶 | 第107-114页 |
| 5.2.1 人类DNA聚合酶η-CPD复合物蛋白质的结构特征 | 第107-110页 |
| 5.2.2 人类DNA聚合酶η的“分子夹板”功能 | 第110-111页 |
| 5.2.3 人类DNA聚合酶η的解离以及替换 | 第111-112页 |
| 5.2.4 人类DNA聚合酶η缺陷以及XPV的关系 | 第112-114页 |
| 5.3 本章讨论 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-117页 |
| 第六章 顺铂药物的拮抗及体细胞超突变 | 第117-138页 |
| 6.1 合成通过Pt-GG的酶动力学 | 第117-119页 |
| 6.1.1 碱基插入的选择性 | 第117-118页 |
| 6.1.2 跨Pt-GG合成的酶动力学分析 | 第118-119页 |
| 6.2 人类DNA聚合酶η与Pt-GG共结晶 | 第119-129页 |
| 6.2.1 人类DNA聚合酶η的结构特征 | 第119-122页 |
| 6.2.2 Pt-GG1：3’G的dCTP正确插入 | 第122-123页 |
| 6.2.3 Pt-GG2：5'G的dCTP正确插入 | 第123-124页 |
| 6.2.4 Pt-GG3：Pt-GG后的第一步延伸 | 第124-126页 |
| 6.2.5 Pt-GG4：二元复合物 | 第126-127页 |
| 6.2.6 跨损伤DNA聚合酶转换模型 | 第127-128页 |
| 6.2.7 可能的抑制剂结合疏水口袋 | 第128-129页 |
| 6.3 人类DNA聚合酶η错误插入 | 第129-135页 |
| 6.3.1 突变热点 | 第129-132页 |
| 6.3.2 人类DNA聚合酶η错误插入 | 第132-135页 |
| 6.4 本章讨论 | 第135-136页 |
| 参考文献 | 第136-138页 |
| 第七章 总结与展望 | 第138-142页 |
| 参考文献 | 第141-142页 |
| 附录 | 第142-149页 |
| 博士期间发表论文 | 第149页 |
