| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 符号说明 | 第14-15页 |
| 第一章 前言 | 第15-25页 |
| 1.1 尼古丁的性质与危害 | 第15-16页 |
| 1.1.1 尼古丁的性质 | 第15页 |
| 1.1.2 尼古丁的危害 | 第15-16页 |
| 1.2 微生物降解尼古丁的研究进展 | 第16-24页 |
| 1.2.1 降解尼古丁的主要微生物 | 第16页 |
| 1.2.2 微生物降解尼古丁的途径及分子生物学研究 | 第16-24页 |
| 1.3 本论文拟开展的研究内容 | 第24-25页 |
| 第二章 Agrobacterium tumefaciens S33基因组测序及注释分析 | 第25-37页 |
| 2.1 材料与方法 | 第25-28页 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 | 第25页 |
| 2.1.2 菌株 | 第25-26页 |
| 2.1.3 培养基 | 第26页 |
| 2.1.4 菌株S33基因组DNA的提取及检测 | 第26页 |
| 2.1.5 菌株S33基因组DNA测序 | 第26页 |
| 2.1.6 菌株S33基因组DNA注释及分析 | 第26-27页 |
| 2.1.7 PCR扩增Scaffold 16缺失区域的序列 | 第27-28页 |
| 2.2 结果与讨论 | 第28-36页 |
| 2.2.1 菌株S33基因组的提取及检测 | 第28-32页 |
| 2.2.2 菌株S33基因组注释 | 第32-33页 |
| 2.2.3 尼古丁降解相关基因分析 | 第33-36页 |
| 2.3 本章小结 | 第36-37页 |
| 第三章 Agrobacterium tumefaciens S33尼古丁降解途径中相关基因的转录分析 | 第37-50页 |
| 3.1 材料与方法 | 第37-42页 |
| 3.1.1 主要试剂和仪器 | 第37-38页 |
| 3.1.2 菌株 | 第38页 |
| 3.1.3 培养基 | 第38页 |
| 3.1.4 菌株S33生长曲线测定 | 第38-39页 |
| 3.1.5 菌株S33总RNA提取 | 第39页 |
| 3.1.6 菌株S33转录组测序 | 第39-40页 |
| 3.1.7 总RNA纯度及完整性检测 | 第40页 |
| 3.1.8 总RNA反转录为cDNA | 第40-41页 |
| 3.1.9 菌株S33基因RT-PCR | 第41-42页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第42-49页 |
| 3.2.1 菌株S33生长曲线测定 | 第42-43页 |
| 3.2.2 总RNA纯度和完整性检测 | 第43-44页 |
| 3.2.3 菌株S33基因RT-PCR | 第44-45页 |
| 3.2.4 菌株S33转录组测序 | 第45-49页 |
| 3.3 本章小结 | 第49-50页 |
| 第四章 尼古丁脱氢酶(Ndh)编码基因的鉴定和敲除验证 | 第50-70页 |
| 4.1 材料和方法 | 第50-58页 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 | 第50-51页 |
| 4.1.2 菌株与质粒 | 第51-52页 |
| 4.1.3 培养基 | 第52页 |
| 4.1.4 菌株S33中尼古丁脱氢酶的分离纯化 | 第52页 |
| 4.1.5 尼古丁脱氢酶质谱测定 | 第52-53页 |
| 4.1.6 菌株S33基因ndhA、ndhB和pno敲除质粒的构建 | 第53-55页 |
| 4.1.7 菌株S33基因ndhA、ndhB和pno分别敲除及生长验证 | 第55-57页 |
| 4.1.8 敲除菌株分别回补及生长验证 | 第57-58页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第58-68页 |
| 4.2.1 尼古丁脱氢酶的分离纯化及蛋白质谱测定结果 | 第58-59页 |
| 4.2.2 菌株S33基因ndhA、pno和ndhB敲除质粒的构建 | 第59-60页 |
| 4.2.3 菌株S33基因ndhA、pno和ndhB分别敲除及生长验证 | 第60-66页 |
| 4.2.4 敲除菌株分别回补及生长验证 | 第66-68页 |
| 4.3 本章小结 | 第68-70页 |
| 第五章 6-羟基尼古丁氧化酶(Hno)的纯化、性质和功能研究 | 第70-83页 |
| 5.1 材料与方法 | 第70-77页 |
| 5.1.1 主要试剂和仪器 | 第70-71页 |
| 5.1.2 菌株和质粒 | 第71页 |
| 5.1.3 培养基 | 第71-72页 |
| 5.1.4 Hno的分离纯化 | 第72-73页 |
| 5.1.5 Hno质谱测定 | 第73-74页 |
| 5.1.6 Hno编码基因的异源表达 | 第74-75页 |
| 5.1.7 His-tag Hno的分离纯化 | 第75-76页 |
| 5.1.8 Hno的催化产物测定 | 第76-77页 |
| 5.1.9 Hno对底物6-羟基尼古丁的K_m的测定 | 第77页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第77-82页 |
| 5.2.1 Hno的分离纯化和质谱测定 | 第77-78页 |
| 5.2.2 hno基因异源表达 | 第78-79页 |
| 5.2.3 His-tag Hno的分离纯化 | 第79-80页 |
| 5.2.4 His-tag Hno的催化产物测定 | 第80-81页 |
| 5.2.5 Hno对底物6-羟基尼古丁的K_m的测定 | 第81-82页 |
| 5.3 本章小结 | 第82-83页 |
| 第六章 6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶(Hsh)的纯化、性质研究及应用 | 第83-107页 |
| 6.1 材料与方法 | 第83-94页 |
| 6.1.1 主要试剂和仪器 | 第83-84页 |
| 6.1.2 菌株和质粒 | 第84-85页 |
| 6.1.3 培养基 | 第85页 |
| 6.1.4 Hsh的分离纯化 | 第85-87页 |
| 6.1.5 Hsh酶学性质测定 | 第87-88页 |
| 6.1.6 Hsh的催化产物测定 | 第88-89页 |
| 6.1.7 Hsh氮端氨基酸残基序列 | 第89-90页 |
| 6.1.8 Hsh基因的异源表达 | 第90-92页 |
| 6.1.9 His-tag Hsh的分离纯化 | 第92页 |
| 6.1.10 His-tag Fdh诱导表达以及纯化 | 第92-93页 |
| 6.1.11 Hsh利用NADH循环体系转化HSP生成2,5-DHP | 第93-94页 |
| 6.2 结果与讨论 | 第94-106页 |
| 6.2.1 Hsh的分离纯化 | 第94-97页 |
| 6.2.2 Hsh的酶学性质测定 | 第97-99页 |
| 6.2.3 Hsh的催化产物测定 | 第99-100页 |
| 6.2.4 Hsh氮端氨基酸序列测定 | 第100页 |
| 6.2.5 Hsh编码基因的异源表达 | 第100-102页 |
| 6.2.6 His-tag Hsh的纯化 | 第102页 |
| 6.2.7 His-tag Fdh的表达纯化 | 第102-103页 |
| 6.2.8 Hsh利用NADH再生体系催化HSP生成2,5-DHP | 第103-106页 |
| 6.3 本章小结 | 第106-107页 |
| 结束语 | 第107-109页 |
| 参考文献 | 第109-115页 |
| 附录 | 第115-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
| 在读期间发表论文 | 第119-120页 |
| 附件 | 第120页 |
