| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-26页 |
| ·当前口蹄疫的分布和流行 | 第13-14页 |
| ·口蹄疫概述 | 第13页 |
| ·口蹄疫的分布和流行 | 第13-14页 |
| ·口蹄疫病毒基因组基本结构及其特性 | 第14-19页 |
| ·5' 非翻译区(5'-UTR) | 第16页 |
| ·VPg、S 片段和poly (C) | 第16页 |
| ·PKs、IRES 和cre | 第16页 |
| ·开放读码框(ORF) | 第16-18页 |
| ·引导蛋白酶( Leader proteinase, L~(pro)) | 第17页 |
| ·结构蛋白P1 编码区 | 第17页 |
| ·非结构蛋白P2、P3 编码区 | 第17-18页 |
| ·3'非翻译区(3'-UTR) | 第18-19页 |
| ·RNAI 实现方法及在免疫相关基因功能鉴定中的应用 | 第19-25页 |
| ·RNAi 转运方式 | 第19-22页 |
| ·理化介导法 | 第19-20页 |
| ·质粒DNA 载体法 | 第20-21页 |
| ·病毒载体法 | 第21-22页 |
| ·siRNA 细胞内形成方式 | 第22-23页 |
| ·直接化学合成 | 第22页 |
| ·体外转录合成 | 第22页 |
| ·由RNaseⅢ催化长的dsRNA 得到siRNA | 第22页 |
| ·由表达载体在细胞内表达siRNA | 第22-23页 |
| ·由PCR 来源的siRNA 表达盒在细胞内表达siRNA | 第23页 |
| ·RNAi 在免疫相关基因功能鉴定中的进展 | 第23-25页 |
| ·RNAi 技术鉴定基因功能的原理 | 第23-24页 |
| ·RNAi 在免疫相关基因功能鉴定中的应用进展 | 第24-25页 |
| ·现存问题及展望 | 第25页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 第二章 口蹄疫病毒SHRNA 的设计及表达载体的构建 | 第26-34页 |
| ·材料与方法 | 第26-31页 |
| ·主要试剂、载体及菌种 | 第26页 |
| ·主要溶液及配制 | 第26-27页 |
| ·FMDV 基因组2B 和3D 基因序列的同源性分析和shRNA 靶序列的选择 | 第27页 |
| ·shRNA 表达模板的设计和合成 | 第27-28页 |
| ·表达shRNA 的DNA 插入片段的载体构建 | 第28-29页 |
| ·pEN/U6-shRNA 表达质粒的构建及鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的大量提取和纯化 | 第30-31页 |
| ·结果 | 第31-32页 |
| ·FMDV 基因组2B 和3D 序列同源性分析结果 | 第31页 |
| ·靶序列的初步筛选结果 | 第31页 |
| ·重组载体pEN/U6-shRNA 的鉴定 | 第31页 |
| ·重组质粒的大量制备与纯化 | 第31-32页 |
| ·讨论 | 第32-34页 |
| ·关于干扰靶区的确定 | 第32页 |
| ·关于shRNA 序列的选择和制备 | 第32-34页 |
| 第三章 口蹄疫病毒3D 基因与增强型绿色荧光蛋白的真核共表达 | 第34-39页 |
| ·材料和方法 | 第34-36页 |
| ·细胞、菌株、载体及毒株 | 第34页 |
| ·试剂 | 第34页 |
| ·引物设计及合成 | 第34-35页 |
| ·病毒RNA 的提取和RT-PCR | 第35页 |
| ·真核共表达质粒pEGFP+3D 的构建 | 第35页 |
| ·重组质粒转染PK-15 细胞 | 第35页 |
| ·EGFP 相对表达分析 | 第35页 |
| ·3D 基因转录水平的检测 | 第35-36页 |
| ·结果 | 第36-38页 |
| ·3D 基因的RT-PCR 扩增 | 第36页 |
| ·重组质粒pEGFP+3D 的鉴定 | 第36页 |
| ·EGFP 在PK-15 细胞内的表达 | 第36页 |
| ·EGFP 的相对表达分析 | 第36-37页 |
| ·3D 基因转录水平检测结果 | 第37-38页 |
| ·讨论 | 第38-39页 |
| 第四章 质粒表达的SHRNA 对保守基因在PK-15 细胞中表达的抑制 | 第39-43页 |
| ·材料和方法 | 第39-40页 |
| ·载体、感受态细菌、细胞株和毒株 | 第39页 |
| ·主要试剂及仪器设备 | 第39页 |
| ·细胞培养用溶液 | 第39页 |
| ·pEN/U6-shRNA 和pEGFP+3D 无内毒素超纯质粒的提取 | 第39-40页 |
| ·pEGFP+3D 质粒与pEN/U6-shRNA 质粒共转染 | 第40页 |
| ·对靶基因对应蛋白表达的抑制效果 | 第40页 |
| ·荧光显微镜观察 | 第40页 |
| ·流式细胞仪检测 | 第40页 |
| ·结果 | 第40-42页 |
| ·荧光显微镜观察shRNA 表达质粒对EGFP+3D 融合蛋白表达的抑制效果 | 第40页 |
| ·流式细胞术检测shRNA 表达质粒对EGFP+3D 融合蛋白抑制效果 | 第40-42页 |
| ·讨论 | 第42-43页 |
| 第五章 慢病毒介导的SHRNA 靶向干扰FMDV 保守基因稳定细胞株的建立 | 第43-51页 |
| ·材料与方法 | 第43-46页 |
| ·试剂、菌种及载体 | 第43页 |
| ·细胞及其培养 | 第43页 |
| ·pLenti6/Dest 慢病毒表达载体的构建及鉴定 | 第43-44页 |
| ·LR 重组反应 | 第43-44页 |
| ·重组体转化感受态细胞及阳性质粒鉴定 | 第44页 |
| ·慢病毒的包装 | 第44页 |
| ·Blasticidin 细胞致死浓度的确定 | 第44页 |
| ·转基因阳性细胞克隆的筛选 | 第44页 |
| ·shRNA 整合基因组的单克隆细胞株的PCR 鉴定 | 第44-45页 |
| ·转基因阳性细胞的抗病毒试验 | 第45-46页 |
| ·转基因阳性细胞接毒 | 第45页 |
| ·间接免疫荧光检测抗病毒水平 | 第45页 |
| ·TCID_(50) 测定转基因阳性细胞抗病毒效果 | 第45页 |
| ·real-time RT-PCR 检测转基因阳性细胞中FMDV 复制的抑制效果 | 第45-46页 |
| ·结果 | 第46-49页 |
| ·pEX/U6-shRNA 表达质粒干扰序列测序鉴定 | 第46页 |
| ·两种细胞杀稻瘟菌素最小致死浓度的确定 | 第46页 |
| ·shRNA 表达盒整合鉴定 | 第46页 |
| ·转基因阳性细胞克隆的获得 | 第46-47页 |
| ·转基因阳性细胞接毒后细胞病变效应(CPE)观察结果 | 第47-48页 |
| ·间接免疫荧光检测转基因阳性细胞的抗病毒效果 | 第48页 |
| ·TCID_(50) 测定转基因阳性细胞抗病毒水平 | 第48页 |
| ·real-time RT-PCR 检测转基因阳性细胞中FMDV 复制的抑制效果 | 第48-49页 |
| ·讨论 | 第49-51页 |
| ·细胞转染和稳定筛选 | 第49-50页 |
| ·转基因阳性细胞克隆的培养和鉴定 | 第50页 |
| ·转基因阳性细胞克隆抑制FMDV 复制的检测 | 第50-51页 |
| 第六章 全文结论 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
| 作者简介 | 第58页 |
