| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-27页 |
| 1.1 谷胱甘肽的性质及其主要应用 | 第15-16页 |
| 1.2 谷胱甘肽的生物合成及其代谢 | 第16-17页 |
| 1.2.1 谷胱甘肽的生物合成 | 第16-17页 |
| 1.2.2 谷胱甘肽的代谢 | 第17页 |
| 1.3 谷胱甘肽的主要生产方法 | 第17-19页 |
| 1.3.1 溶剂萃取法 | 第17-18页 |
| 1.3.2 化学合成法 | 第18页 |
| 1.3.3 发酵法 | 第18页 |
| 1.3.4 酶法 | 第18-19页 |
| 1.4 谷胱甘肽双功能酶GSHF | 第19-21页 |
| 1.4.1 简介 | 第19页 |
| 1.4.2 谷胱甘肽双功能酶的研究背景 | 第19-21页 |
| 1.4.3 谷胱甘肽双功能酶的结构 | 第21页 |
| 1.5 ATP再生体系 | 第21-23页 |
| 1.5.1 简介 | 第21-22页 |
| 1.5.2 多聚磷酸激酶PPK | 第22-23页 |
| 1.6 大肠杆菌重组表达系统 | 第23-26页 |
| 1.6.1 可溶表达策略 | 第23-25页 |
| 1.6.2 大肠杆菌的高密度发酵 | 第25-26页 |
| 1.7 本论文的研究内容与目的 | 第26-27页 |
| 第二章 材料与方法 | 第27-36页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第27-28页 |
| 2.2 仪器与试剂 | 第28-30页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.2.2 工具酶与主要试剂 | 第29-30页 |
| 2.3 培养基 | 第30页 |
| 2.4 分子生物学相关操作 | 第30-32页 |
| 2.4.1 分子克隆相关实验 | 第30-31页 |
| 2.4.2 大肠杆菌菌浓测定 | 第31页 |
| 2.4.3 大肠杆菌细胞超声破碎 | 第31-32页 |
| 2.4.4 蛋白浓度测定 | 第32页 |
| 2.4.5 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第32页 |
| 2.5 谷胱甘肽双功能酶GsHF的酶活测定 | 第32-33页 |
| 2.5.1 谷胱甘肽的酶催化合成 | 第32-33页 |
| 2.5.2 谷胱甘肽的检测 | 第33页 |
| 2.6 ATP、ADP、AMP的高效液相色谱(HPLC)分析 | 第33-36页 |
| 第三章 谷胱甘肽双功能酶在大肠杆菌中的重组表达与优化 | 第36-45页 |
| 3.1 引言 | 第36页 |
| 3.2 实验材料 | 第36-37页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第36-37页 |
| 3.2.2 工具酶和主要试剂 | 第37页 |
| 3.2.3 培养基与培养条件 | 第37页 |
| 3.3 实验方法 | 第37-39页 |
| 3.3.1 引物设计 | 第37页 |
| 3.3.2 谷胱甘肽双功能酶基因片段的获得 | 第37页 |
| 3.3.3 pET28a(+)-GshF表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 3.3.4 谷胱甘肽双功能酶GshF的重组表达 | 第38页 |
| 3.3.5 GshF的表达条件的优化 | 第38-39页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第39-43页 |
| 3.4.1 谷胱甘肽双功能酶基因的克隆 | 第39页 |
| 3.4.2 pET28a(+)-GshF高效表达载体构建及其双酶切验证 | 第39-40页 |
| 3.4.3 重组蛋白GshF的表达 | 第40-41页 |
| 3.4.4 诱导条件对GshF表达的影响 | 第41-43页 |
| 3.5 小结 | 第43-45页 |
| 第四章 谷胱甘肽双功能酶GSHF的纯化与酶学性质的研究 | 第45-54页 |
| 4.1 引言 | 第45页 |
| 4.2 实验材料 | 第45-46页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第45页 |
| 4.2.2 主要试剂与设备 | 第45-46页 |
| 4.2.3 培养基与培养条件 | 第46页 |
| 4.3 实验方法 | 第46-48页 |
| 4.3.1 发酵液的处理 | 第46页 |
| 4.3.2 蛋白纯化 | 第46-47页 |
| 4.3.3 脱盐 | 第47页 |
| 4.3.4 蛋白浓度测定与酶活测定 | 第47页 |
| 4.3.5 谷胱甘肽双功能酶GshF的酶学性质分析 | 第47-48页 |
| 4.3.6 利用GshF体外催化合成谷胱甘肽 | 第48页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第48-52页 |
| 4.4.1 蛋白纯化 | 第48-49页 |
| 4.4.2 酶学性质分析 | 第49-52页 |
| 4.4.3 利用GshF体外催化合成谷胱甘肽 | 第52页 |
| 4.5 小结 | 第52-54页 |
| 第五章 以甘油为碳源产GSHF的放大培养 | 第54-59页 |
| 5.1 引言 | 第54页 |
| 5.2 材料与方法 | 第54-57页 |
| 5.2.1 表达菌株 | 第54页 |
| 5.2.2 主要设备 | 第54页 |
| 5.2.3 培养基 | 第54-55页 |
| 5.2.4 培养方法 | 第55-56页 |
| 5.2.5 甘油浓度测定 | 第56-57页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第57-58页 |
| 5.4 小结 | 第58-59页 |
| 第六章 大肠杆菌来源重组聚磷酸激酶PPK用于再生ATP合成谷胱甘肽 | 第59-68页 |
| 6.1 引言 | 第59页 |
| 6.2 实验材料 | 第59-60页 |
| 6.2.1 菌株与质粒 | 第59页 |
| 6.2.2 主要试剂与设备 | 第59页 |
| 6.2.3 培养基与培养条件 | 第59-60页 |
| 6.3 实验方法 | 第60-61页 |
| 6.3.1 大肠杆菌ppk基因的获得 | 第60页 |
| 6.3.2 pET28a(+)-PPK表达质粒的构建 | 第60页 |
| 6.3.3 PPK的表达纯化 | 第60页 |
| 6.3.4 PPK的亲和纯化 | 第60页 |
| 6.3.5 PPK的酶活测定 | 第60-61页 |
| 6.3.6 PPK与GshF相偶联用于谷胱甘肽的合成 | 第61页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第61-67页 |
| 6.4.1 大肠杆菌ppk的克隆 | 第61-62页 |
| 6.4.2 pET28a (+)-ppk表达质粒的构建及酶切验证 | 第62页 |
| 6.4.3 多聚磷酸激酶PPK的表达 | 第62-63页 |
| 6.4.4 多聚磷酸激酶PPK亲和纯化 | 第63-64页 |
| 6.4.5 多聚磷酸激酶PPK的酶活测定 | 第64-66页 |
| 6.4.6 PPK与GshF偶联用于合成谷胱甘肽 | 第66-67页 |
| 6.5 小结 | 第67-68页 |
| 第七章 结论与展望 | 第68-70页 |
| 7.1 结论 | 第68-69页 |
| 7.2 展望 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-77页 |
| 作者简介 | 第77页 |
