| 符号说明 | 第4-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 1 引言 | 第13-23页 |
| 1.1 果胶甲酯酶研究进展 | 第13-18页 |
| 1.1.1 果胶甲酯酶的发现 | 第14页 |
| 1.1.2 果胶甲酯酶的结构与分类 | 第14-16页 |
| 1.1.3 果胶甲酯酶的作用机制 | 第16-17页 |
| 1.1.4 果胶甲酯酶与植物花粉发育 | 第17-18页 |
| 1.2 果胶甲酯酶抑制剂（PMEI） | 第18-19页 |
| 1.3 果胶甲酯酶的原核表达与活性分析 | 第19-20页 |
| 1.4 蛋白质亚细胞定位研究 | 第20-22页 |
| 1.4.1 蛋白质亚细胞定位研究意义 | 第20页 |
| 1.4.2 蛋白质亚细胞定位研究方法 | 第20-22页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第22-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-40页 |
| 2.1 试验材料 | 第23-24页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第23页 |
| 2.1.2 菌株 | 第23页 |
| 2.1.3 载体与质粒 | 第23页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第24页 |
| 2.1.6 PCR引物的合成 | 第24页 |
| 2.2 方法 | 第24-40页 |
| 2.2.1 洋葱总DNA的提取 | 第24页 |
| 2.2.2 洋葱总RNA的提取 | 第24-25页 |
| 2.2.3 电泳检测 | 第25页 |
| 2.2.4 胶回收与PCR产物纯化 | 第25页 |
| 2.2.5 PCR产物的连接、转化及蓝白板筛选 | 第25-26页 |
| 2.2.6 质粒DNA提取 | 第26页 |
| 2.2.7 测序与序列分析 | 第26页 |
| 2.2.8 洋葱AcPME基因的克隆 | 第26-28页 |
| 2.2.8.1 cDNA第一条链的合成 | 第26页 |
| 2.2.8.2 cDNA末端扩增（3ˊ和 5ˊRACE） | 第26-27页 |
| 2.2.8.3 AcPME基因全长DNA和m RNA的获得 | 第27-28页 |
| 2.2.9 洋葱AcPME/AcPMEI基因的原核表达 | 第28-33页 |
| 2.2.9.1 PME、PMEI和PMEI-PME片段的扩增 | 第28页 |
| 2.2.9.2 基于pGEX4T-1 和pET24a系列的原核表达载体及工程菌的构建 | 第28-29页 |
| 2.2.9.3 基于pGEX4T-1 和pET24a系列重组质粒的蛋白质表达初探 | 第29-30页 |
| 2.2.9.4 SDS-PAGE电泳检测 | 第30页 |
| 2.2.9.5 pGEX4T1PME/pET24a-PMEI蛋白表达条件的优化 | 第30-31页 |
| 2.2.9.6 pGEX4T1PME/pET24a-PMEI蛋白质诱导大量表达 | 第31页 |
| 2.2.9.7 pGEX4T1PME蛋白纯化 | 第31-32页 |
| 2.2.9.8 pET24a-PMEI蛋白纯化 | 第32-33页 |
| 2.2.10 生物活性分析 | 第33页 |
| 2.2.11 洋葱AcPME蛋白亚细胞定位 | 第33-40页 |
| 2.2.11.1 烟草叶片瞬时表达 | 第33-35页 |
| 2.2.11.2 转基因拟南芥根尖细胞定位 | 第35-36页 |
| 2.2.11.3 洋葱基因枪瞬时表达 | 第36-39页 |
| 2.2.11.4 荧光观察 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-60页 |
| 3.1 洋葱总DNA和RNA提取结果 | 第40页 |
| 3.2 洋葱ACPME基因的克隆 | 第40-44页 |
| 3.2.1 洋葱AcPME基因 3ˊ、5ˊRACE及全长DNA和cDNA的扩增 | 第40-41页 |
| 3.2.2 AcPME基因的序列分析 | 第41-42页 |
| 3.2.3 AcPME蛋白同源比对与系统进化 | 第42-44页 |
| 3.2.4 AcPME蛋白进化树分析及三维结构图 | 第44页 |
| 3.3 洋葱ACPME/ACPMEI基因的原核表达 | 第44-53页 |
| 3.3.1 原核表达载体构建 | 第44-45页 |
| 3.3.2 目的蛋白诱导表达 | 第45-47页 |
| 3.3.2.1 目的蛋白的小量表达 | 第45-46页 |
| 3.3.2.2 目的蛋白存在形式 | 第46-47页 |
| 3.3.3 目的蛋白表达条件的优化 | 第47-49页 |
| 3.3.3.1 pGEX4T1PME蛋白表达条件的优化 | 第47-48页 |
| 3.3.3.2 pET 24a-PMEI蛋白表达条件的优化 | 第48-49页 |
| 3.3.4 目的蛋白纯化 | 第49-51页 |
| 3.3.4.1 pGEX4T1PME蛋白纯化 | 第49-50页 |
| 3.3.4.2 pET 24a-PMEI蛋白纯化 | 第50-51页 |
| 3.3.5 生物活性分析 | 第51-53页 |
| 3.4 洋葱ACPME蛋白亚细胞定位 | 第53-60页 |
| 3.4.1 烟草叶片注射瞬时表达 | 第53-55页 |
| 3.4.1.1 亚细胞定位载体的获得与验证 | 第53-54页 |
| 3.4.1.2 AcPME基因在烟草中的亚细胞定位 | 第54-55页 |
| 3.4.2 洋葱AcPME蛋白在拟南芥中的定位 | 第55-56页 |
| 3.4.2.1 拟南芥的转化与筛选 | 第55页 |
| 3.4.2.2 转基因拟南芥植株PCR鉴定及定位 | 第55-56页 |
| 3.4.3 洋葱AcPME蛋白在洋葱表皮中的定位 | 第56-60页 |
| 3.4.3.1 洋葱表皮瞬时定位载体的获得与验证 | 第56-58页 |
| 3.4.3.2 AcPME在洋葱表皮细胞中的定位 | 第58-60页 |
| 4 讨论 | 第60-64页 |
| 4.1 ACPME基因的分类 | 第60页 |
| 4.2 ACPME和ACPMEI的原核表达系统 | 第60-61页 |
| 4.3 ACPME基因与洋葱育性 | 第61-62页 |
| 4.4 蛋白表达条件的优化及蛋白纯化 | 第62-63页 |
| 4.5 ACPME蛋白亚细胞定位 | 第63-64页 |
| 5 结论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-74页 |
| 附录 | 第74-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 | 第78页 |
