| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-19页 |
| ·海参概述 | 第11-12页 |
| ·海参的营养价值 | 第11页 |
| ·国内外海参的分布与产量 | 第11-12页 |
| ·海参的自溶 | 第12-13页 |
| ·海参内源酶 | 第13页 |
| ·半胱氨酸蛋白酶 | 第13-14页 |
| ·半胱氨酸蛋白酶抑制剂 | 第14-16页 |
| ·组织蛋白酶与半胱氨酸蛋白酶抑制剂的关系 | 第16-18页 |
| ·研究的意义与内容 | 第18-19页 |
| 第二章 Cystatin基因的克隆、原核表达及其在自溶中的变化规律研究 | 第19-42页 |
| ·实验材料 | 第19-25页 |
| ·原料 | 第19页 |
| ·主要仪器 | 第19-20页 |
| ·主要试剂 | 第20-22页 |
| ·所用试剂配方 | 第22-25页 |
| ·实验方法 | 第25-42页 |
| ·刺参Total RNA的提取 | 第25页 |
| ·刺参SjCyt基因的获取 | 第25-32页 |
| ·引物设计与合成 | 第25-26页 |
| ·cDNA的合成及特异性序列的获取 | 第26-27页 |
| ·刺参Cystatin基因的3’RACE扩增、克隆、测序 | 第27-30页 |
| ·刺参Cystatin基因开放阅读框(ORF)验证及质粒保存 | 第30-32页 |
| ·刺参SjCyt cDNA全长序列的生物信息学分析 | 第32-33页 |
| ·等电点(pI)/分子量(Mw)的预测 | 第32页 |
| ·信号肽预测 | 第32页 |
| ·氨基酸疏水性预测 | 第32页 |
| ·蛋白跨膜区预测 | 第32页 |
| ·蛋白保守位点及结构域预测 | 第32页 |
| ·蛋白质二级结构及三级结构预测 | 第32页 |
| ·同源性比对、进化树构建 | 第32-33页 |
| ·刺参SjCyt、SjCL基因表达模式分析 | 第33-36页 |
| ·刺参不同部位样品采集及自溶诱导实验 | 第33页 |
| ·总RNA的提取 | 第33页 |
| ·RNA纯化及反转录 | 第33-34页 |
| ·引物设计与合成 | 第34-35页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第35-36页 |
| ·建立标准曲线 | 第36页 |
| ·△△Ct法验证 | 第36页 |
| ·样品检测及数据处理 | 第36页 |
| ·刺参SjCyt原核表达载体的构建及蛋白表达 | 第36-42页 |
| ·引物设计 | 第36-37页 |
| ·PCR扩增CDS区 | 第37页 |
| ·载体DNA的制备 | 第37-38页 |
| ·目的片段与载体DNA连接 | 第38页 |
| ·重组质粒的转化、测序 | 第38页 |
| ·大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| ·原核表达载体转化 | 第39页 |
| ·重组菌的培养及诱导 | 第39-40页 |
| ·重组菌诱导条件优化 | 第40-42页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第42-68页 |
| ·总RNA提取检验 | 第42页 |
| ·刺参SjCyt基因的获取 | 第42-44页 |
| ·特异性序列获取 | 第42-43页 |
| ·cDNA全长序列的获取 | 第43-44页 |
| ·刺参SjCyt cDNA全长序列的生物信息学分析 | 第44-51页 |
| ·等电点(pI)/分子量(Mw)的预测 | 第45页 |
| ·信号肽预测结果 | 第45页 |
| ·氨基酸疏水性结果分析 | 第45-46页 |
| ·蛋白质跨膜区域预测结果 | 第46-47页 |
| ·保守位点及结构域分析 | 第47页 |
| ·蛋白质二级结构和三级结构的预测 | 第47-49页 |
| ·同源性比对和进化树构建 | 第49-51页 |
| ·刺参SjCyt、SjCL基因表达模式分析 | 第51-63页 |
| ·RNA提取结果 | 第51-52页 |
| ·标准曲线的建立 | 第52-57页 |
| ·内参基因Cytb PCR标准曲线 | 第52-54页 |
| ·目的基因SjCyt PCR标准曲线 | 第54-55页 |
| ·目的基因SjCL PCR标准曲线 | 第55-57页 |
| ·△△Ct法验证结果 | 第57-58页 |
| ·管家基因Cytb和目的基因Sjcyt的△△Ct法验证结果 | 第57-58页 |
| ·管家基因Cytb和目的基因SjCL的△△Ct法验证结果 | 第58页 |
| ·实时荧光定量结果 | 第58-63页 |
| ·组织表达定量结果 | 第58-60页 |
| ·时序表达定量结果 | 第60-63页 |
| ·SjCyt原核表达载体的构建及蛋白表达 | 第63-68页 |
| ·原核表达载体构建 | 第63-64页 |
| ·重组菌的低温诱导表达 | 第64-66页 |
| ·重组菌诱导条件优化 | 第66-68页 |
| ·IPTG浓度优化 | 第66-67页 |
| ·诱导温度优化 | 第67-68页 |
| 第四章 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
