| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 1 前言 | 第12-30页 |
| ·番木瓜环斑病和番木瓜环斑病毒(PRSV) | 第12-17页 |
| ·概述 | 第12-13页 |
| ·PRSV基因组学 | 第13-17页 |
| ·PRSV基因组结构 | 第13-14页 |
| ·PRSV编码蛋白的功能 | 第14-16页 |
| ·序列多样性及进化 | 第16-17页 |
| ·番木瓜环斑病的防治 | 第17-26页 |
| ·常规方法 | 第17-20页 |
| ·基因工程 | 第20-26页 |
| ·RNA沉默介导的植物抗病毒机制 | 第20-23页 |
| ·基因工程在抗番木瓜环斑病毒研究中的应用 | 第23-25页 |
| ·抗病毒转基因植物的安全风险分析 | 第25-26页 |
| ·利用原核表达的dsRNA抗植物病毒研究进展 | 第26-28页 |
| ·本研究的目的与意义 | 第28-30页 |
| 2 实验材料、试剂及仪器等 | 第30-35页 |
| ·植物和病毒材料 | 第30页 |
| ·大肠杆菌菌株 | 第30页 |
| ·质粒载体 | 第30-32页 |
| ·引物 | 第32-34页 |
| ·仪器 | 第34-35页 |
| 3 实验方法 | 第35-60页 |
| ·原核表达PRSV编码基因同源dsRNA的研究 | 第35-44页 |
| ·PRSV不同编码基因序列的克隆 | 第35-36页 |
| ·PRSV编码基因同源dsRNA原核表达载体的构建 | 第36-41页 |
| ·含内含子的发夹RNA编码结构的构建 | 第36-40页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第40-41页 |
| ·PRSV编码基因同源dsRNA原核表达工程菌株的构建 | 第41-42页 |
| ·PRSV编码基因同源dsRNA的诱导表达 | 第42-44页 |
| ·利用番木瓜叶片原生质体瞬时表达体系检测dsRNA的沉默效果 | 第44-50页 |
| ·PRSV编码基因-GFP瞬时植物融合表达载体的构建 | 第44-46页 |
| ·番木瓜叶片原生质体的分离和转化 | 第46-48页 |
| ·试剂的配制 | 第46-47页 |
| ·原生质体的分离 | 第47页 |
| ·瞬时融合植物表达载体与dsRNA共转化番木瓜叶片原生质体 | 第47-48页 |
| ·PRSV不同编码基因序列-GFP融合mRNA表达量的半定量RT-PCR检测 | 第48-50页 |
| ·番木瓜叶片原生质体细胞总RNA的提取 | 第49页 |
| ·RT-PCR检测mRNA表达量 | 第49-50页 |
| ·原核表达的PRSV编码基因同源dsRNA抗番木瓜环斑病毒的研究 | 第50-59页 |
| ·dsRNA粗制品制备方法的筛选 | 第50-52页 |
| ·高压细胞破碎法 | 第50页 |
| ·溶菌酶法 | 第50-51页 |
| ·冻融法 | 第51页 |
| ·粗制品中dsRNA的提取 | 第51-52页 |
| ·粗制品中dsRNA的稳定性检测 | 第52页 |
| ·接种PRSV至番木瓜植株 | 第52页 |
| ·使用dsRNA粗制品处理番木瓜植株 | 第52-54页 |
| ·保护性处理 | 第53页 |
| ·治疗性处理 | 第53-54页 |
| ·ELISA分析 | 第54-55页 |
| ·实时定量分析 | 第55-57页 |
| ·番木瓜叶片总RNA的提取 | 第56页 |
| ·反转录 | 第56页 |
| ·Real Time PCR | 第56-57页 |
| ·siRNA Northern杂交 | 第57-59页 |
| ·RNA探针的制备 | 第57页 |
| ·siRNA提取 | 第57-58页 |
| ·PAGE电泳 | 第58页 |
| ·转膜 | 第58-59页 |
| ·siRNA杂交和放射自显影 | 第59页 |
| ·使用N809-dsRNA粗制品抗番木瓜环斑病的田间试验 | 第59-60页 |
| 4 结果 | 第60-81页 |
| ·含PRSV不同编码基因序列dsRNA的原核表达 | 第60-64页 |
| ·PRSV不同编码基因序列的克隆 | 第60页 |
| ·含PRSV不同编码蛋白基因序列dsRNA原核表达载体的构建 | 第60-63页 |
| ·含内含子的发夹RNA编码结构的构建 | 第60-62页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第62-63页 |
| ·含PRSV不同编码基因序列的dsRNA原核表达工程菌株的构建 | 第63页 |
| ·含PRSV不同编码基因序列dsRNA的诱导表达 | 第63-64页 |
| ·利用番木瓜叶片原生质体瞬时表达体系检测dsRNA的沉默效果 | 第64-69页 |
| ·PRSV不同编码基因序列-GFP瞬时植物融合表达载体的构建 | 第64-66页 |
| ·番木瓜叶片原生质体的分离和转化 | 第66-68页 |
| ·番木瓜叶片原生质体的分离 | 第66页 |
| ·番木瓜叶片原生质体的转化 | 第66-68页 |
| ·PRSV不同编码基因-GFP融合mRNA表达量的半定量RT-PCR检测 | 第68-69页 |
| ·利用原核表达的含PRSV不同编码基因序列dsRNA防治番木瓜环斑病 | 第69-79页 |
| ·dsRNA粗制品制备方法的筛选 | 第69页 |
| ·粗制品中dsRNA的稳定性检测 | 第69-70页 |
| ·dsRNA介导的抗病性鉴定 | 第70-79页 |
| ·保护作用 | 第70-76页 |
| ·番木瓜植株的发病情况 | 第70-72页 |
| ·保护处理后第2天接种PRSV的番木瓜植株发病情况 | 第70-71页 |
| ·保护处理后第3天和第5天接种PRSV的番木瓜植株发病情况 | 第71-72页 |
| ·ELISA分析 | 第72-74页 |
| ·实时定量分析 | 第74-75页 |
| ·siRNA Northern杂交检测 | 第75-76页 |
| ·治疗作用 | 第76-79页 |
| ·番木瓜环斑病症状的发展情况 | 第76页 |
| ·ELISA分析 | 第76-78页 |
| ·实时定量分析 | 第78页 |
| ·siRNA Northern杂交检测 | 第78-79页 |
| ·N809-dsRNA粗制品抗番木瓜环斑病的田间试验 | 第79-81页 |
| 5 讨论 | 第81-86页 |
| ·dsRNA原核表达载体 | 第81-82页 |
| ·dsRNA原核表达宿主菌 | 第82页 |
| ·dsRNA的摄入途径 | 第82-83页 |
| ·dsRNA的稳定性及其制品的制备方法 | 第83-84页 |
| ·dsRNA介导的抗病性 | 第84-86页 |
| 6 结论 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-94页 |
| 致谢 | 第94页 |
