| 摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 1 引言 | 第17-31页 |
| 1．1 昆虫几丁质酶cDNA的克隆方法 | 第17-18页 |
| 1．1．1 利用标记的探针筛选cDNA文库 | 第18页 |
| 1．1．2 通过对文库的随机测序克隆昆虫的几丁质酶基因 | 第18页 |
| 1．1．3 通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆昆虫几丁质酶基因 | 第18页 |
| 1．2 目前已克隆的昆虫几丁质酶基因种类 | 第18-19页 |
| 1．3 昆虫几丁质酶基因氨基酸同源性分析 | 第19-22页 |
| 1．4 昆虫几丁质酶氨基酸结构特点 | 第22-23页 |
| 1．5 昆虫几丁质酶的基因结构特点 | 第23-24页 |
| 1．6 昆虫几丁质酶的基因的拷贝数研究 | 第24页 |
| 1．7 昆虫体内几丁质酶基因的时空表达 | 第24-26页 |
| 1．7．1 昆虫几丁质酶基因的不同发育阶段表达 | 第25页 |
| 1．7．2 昆虫几丁质酶基因的组织特异性表达 | 第25-26页 |
| 1．8 昆虫几丁质酶基因的体外表达及活性测定 | 第26-27页 |
| 1．8．1 昆虫几丁质酶基因的表达系统 | 第26页 |
| 1．8．2 昆虫几丁质酶酶活性测定方法 | 第26-27页 |
| 1．8．3 不同pH、不同温度对昆虫几丁质酶活性的影响 | 第27页 |
| 1．9 几丁质酶基因在植物抗虫方面的应用 | 第27-29页 |
| 1．9．1 几丁质酶和Bt基因的协同作用 | 第27-28页 |
| 1．9．2 昆虫杆状病毒表达系统在几丁质酶抗虫研究中的应用 | 第28页 |
| 1．9．3 昆虫几丁质酶在作物抗虫方面存在的问题 | 第28-29页 |
| 1．10 重要农业害虫-甜菜夜蛾、粘虫、二化螟、玉米螟简介 | 第29页 |
| 1．11 本论文研究的目的与意义 | 第29-30页 |
| 1．12 本研究课题的来源及主要研究内容 | 第30-31页 |
| 2 材料与方法 | 第31-61页 |
| 2．1 材料 | 第31-33页 |
| 2．1．1 菌株与质粒 | 第31页 |
| 2．1．2 分子生物学用酶及试剂盒和各种试剂 | 第31-33页 |
| 2．1．3 培养基 | 第33页 |
| 2．1．4 仪器设备 | 第33页 |
| 2．1．5 试虫来源 | 第33页 |
| 2．2 研究方法 | 第33-43页 |
| 2．2．1 几丁质酶mRNA高峰表达时间的确定 | 第34-35页 |
| 2．2．2 昆虫总 RNA提取 | 第35-36页 |
| 2．2．3 利用RT-PCR扩增保守区之间的cDNA序列 | 第36-38页 |
| 2．2．4 RACE引物设计 | 第38-39页 |
| 2．2．5 3′-RACE的实验步骤 | 第39-40页 |
| 2．2．6 5′-RACE的实验步骤 | 第40-42页 |
| 2．2．7 全长cDNA的获取及其序列分析 | 第42-43页 |
| 2．3 玉米螟中肠cDNA文库的构建 | 第43-46页 |
| 2．3．1 提取玉米螟中肠的RNA | 第43页 |
| 2．3．2 合成cDNA第一链 | 第43页 |
| 2．3．3 cDNA的LD-PCR扩增 | 第43-44页 |
| 2．3．4 cDNA文库的构建 | 第44-45页 |
| 2．3．5 文库的扩增 | 第45-46页 |
| 2．4 cDNA序列分析 | 第46-47页 |
| 2．4．1 利用Blast软件进行序列相似性检索 | 第46页 |
| 2．4．2 分子质量、碱基组成、碱基分布 | 第46页 |
| 2．4．3 全长cDNA可读框架分析 | 第46页 |
| 2．4．4 对ORF进行限制性酶切分析 | 第46页 |
| 2．4．5 基于核酸序列对齐分析的功能预测 | 第46-47页 |
| 2．5 蛋白质基本性质分析 | 第47页 |
| 2．5．1 疏水性分析 | 第47页 |
| 2．5．2 信号肽分析 | 第47页 |
| 2．6 蛋白质功能预测 | 第47-48页 |
| 2．6．1 通过蛋白质序列同源性分析的蛋白质功能预测 | 第48页 |
| 2．6．2 通过motif、结构位点、结构功能域数据库的蛋白质功能预测 | 第48页 |
| 2．7 蛋白质结构预测 | 第48-49页 |
| 2．7．1 蛋白质二级结构预测 | 第48页 |
| 2．7．2 蛋白质三级结构预测 | 第48-49页 |
| 2．8 昆虫几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达研究 | 第49-53页 |
| 2．8．1 几丁质酶基因cDNA序列ORF的PCR反应 | 第49页 |
| 2．8．2 PCR产物酶切反应 | 第49页 |
| 2．8．3 E．coli质粒DNA提取和酶切 | 第49-50页 |
| 2．8．4 大肠杆菌表达载体构建 | 第50页 |
| 2．8．5 几丁质酶基因在大肠杆菌中诱导表达 | 第50页 |
| 2．8．6 SDS-PAGE电泳 | 第50-53页 |
| 2．9 昆虫几丁质酶基因在酵母中的表达研究 | 第53-56页 |
| 2．9．1 毕赤酵母Pichia pastoris表达载体的构建 | 第53页 |
| 2．9．2 转化酵母和抗G418重组菌的筛选 | 第53-55页 |
| 2．9．3 转化子的PCR检测 | 第55-56页 |
| 2．9．4 目的基因在毕赤酵母中的诱导表达 | 第56页 |
| 2．10 CM-chitin-RBV为底物的酶活性测定 | 第56-57页 |
| 2．10．1 包涵体的溶解 | 第56页 |
| 2．10．2 包涵体的分离 | 第56页 |
| 2．10．3 包涵体溶解后的透析复性 | 第56-57页 |
| 2．10．4 酶活性测定 | 第57页 |
| 2．10．5 pH值对几丁质酶活性的影响 | 第57页 |
| 2．10．6 温度对酶活性的影响 | 第57页 |
| 2．10．7 Impact和酵母表达系统表达的几丁质酶活性测定 | 第57页 |
| 2．11 杀虫活性测定 | 第57-58页 |
| 2．11．1 以甜菜夜蛾1龄幼虫为试虫进行杀虫活性测定 | 第57-58页 |
| 2．11．2 以小菜蛾2龄幼虫为试虫进行杀虫活性测定 | 第58页 |
| 2．11．3 以粘虫1龄幼虫为试虫进行杀虫活性测定 | 第58页 |
| 2．12 中肠蛋白水解酶提取液对几丁质酶的消化作用 | 第58-59页 |
| 2．12．1 中肠蛋白水解酶的提取 | 第58页 |
| 2．12．2 蛋白水解酶对几丁质酶的消化 | 第58-59页 |
| 2．13 几丁质酶对昆虫中肠围食膜几丁质的分解作用 | 第59页 |
| 2．13．1 昆虫中肠围食膜的提取 | 第59页 |
| 2．13．2 几丁质酶对围食膜胶体几丁质进行分解作用 | 第59页 |
| 2．14 半定量RT-PCR对几丁质酶基因表达水平研究 | 第59-61页 |
| 2．14．1 总RNA的提取 | 第59页 |
| 2．14．2 cDNA第一链的合成 | 第59页 |
| 2．14．3 cDNA样品的标准化 | 第59-60页 |
| 2．14．4 PCR循环数实验 | 第60页 |
| 2．14．5 半定量RT-PCR反应 | 第60-61页 |
| 3 实验结果 | 第61-103页 |
| 3．1 昆虫几丁质酶 RNA提取时间的确定 | 第61-62页 |
| 3．2 昆虫总RNA的提取 | 第62-63页 |
| 3．2．1 RNA完整性的检测 | 第62页 |
| 3．2．2 纯度及产量检测 | 第62-63页 |
| 3．3 几丁质酶的基因特异性片段的获得及序列分析 | 第63页 |
| 3．4 几丁质酶基因cDNA序列的3′-RACE结果 | 第63页 |
| 3．5 几丁质酶基因cDNA序列的5′-RACE结果 | 第63-64页 |
| 3．6 玉米螟中肠cDNA文库的构建 | 第64-65页 |
| 3．6．1 玉米螟中肠总RNA的提取、RNA完整性、纯度及产量检测 | 第64页 |
| 3．6．2 cDNA的合成 | 第64页 |
| 3．6．3 cDNA文库的大小和质量检测结果 | 第64-65页 |
| 3．6．4 扩增文库的滴度测定 | 第65页 |
| 3．7 几丁质酶基因全长cDNA序列的获得 | 第65-76页 |
| 3．7．1 甜菜夜蛾几丁质酶基因全长cDNA序列及推导的氨基酸序列 | 第65-68页 |
| 3．7．2 粘虫几丁质酶基因全长cDNA序列及推导的氨基酸序列 | 第68-70页 |
| 3．7．3 二化螟几丁质酶基因全长cDNA序列及推导的氨基酸序列 | 第70-72页 |
| 3．7．4 玉米螟几丁质酶基因全长cDNA序列及推导的氨基酸序列 | 第72-76页 |
| 3．8 四种昆虫几丁质酶基因的特征比较 | 第76-79页 |
| 3．8．1 不同昆虫几丁质酶碱基序列组成 | 第76页 |
| 3．8．2 不同昆虫几丁质酶氨基酸序列组成分析 | 第76-77页 |
| 3．8．3 不同种类昆虫几丁质酶推导的氨基酸的组成比较 | 第77页 |
| 3．8．4 不同种类昆虫几丁质酶推导的氨基酸序列二级结构预测 | 第77-79页 |
| 3．9 几种昆虫几丁质酶氨基酸结构域预测 | 第79-84页 |
| 3．9．1 甜菜夜蛾几丁质酶氨基酸结构域预测 | 第80页 |
| 3．9．2 玉米螟几丁质酶氨基酸结构域预测 | 第80-81页 |
| 3．9．3 O-位上的糖基化位点和PEST区预测 | 第81-83页 |
| 3．9．4 CDDV2．01软件进行功能区的搜索 | 第83-84页 |
| 3．10 昆虫几丁质酶氨基酸的疏水性分析 | 第84-86页 |
| 3．11 昆虫几丁质酶的同源性比较和系统进化分析 | 第86-92页 |
| 3．11．1 序列同源性比较 | 第86-90页 |
| 3．11．2 昆虫几丁质酶基因的系统进化分析 | 第90-92页 |
| 3．13 昆虫几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第92-94页 |
| 3．13．1 大肠杆菌重组表达载体的构建和鉴定 | 第92-93页 |
| 3．13．2 昆虫几丁质酶基因在大肠杆菌中的融合表达 | 第93-94页 |
| 3．14 昆虫几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第94-95页 |
| 3．14．1 酵母重组表达载体的构建和鉴定 | 第94页 |
| 3．14．2 重组蛋白在毕赤酵母中的表达 | 第94-95页 |
| 3．15 CM-chitin-RBV为底物的酶活性测定 | 第95-97页 |
| 3．15．1 pET29a载体表达的昆虫几丁质酶活性测定结果 | 第95-96页 |
| 3．15．2 pTYB11表达的昆虫几丁质酶活性测定 | 第96-97页 |
| 3．15．3 毕赤酵母表达的甜菜夜蛾几丁质酶活性测定 | 第97页 |
| 3．16 昆虫几丁质酶杀虫活性测定结果 | 第97页 |
| 3．17 昆虫中肠蛋白水解酶对几丁质酶的消化作用 | 第97-99页 |
| 3．18 几丁质酶对昆虫中肠围食膜几丁质的分解作用 | 第99页 |
| 3．19 几丁质酶基因表达水平研究结果 | 第99-103页 |
| 3．19．1 PCR循环数实验结果 | 第99-100页 |
| 3．19．2 目的基因和内参基因浓度定量结果 | 第100-103页 |
| 4 讨论 | 第103-108页 |
| 4．1 RNA的提取 | 第103页 |
| 4．2 RACE反应中需注意的问题 | 第103-104页 |
| 4．3 cDNA基因文库构建技术问题 | 第104-105页 |
| 4．3．1 构建理想的cDNA文库需要考虑的因素 | 第104-105页 |
| 4．3．2 文库筛选可选择的具体方法 | 第105页 |
| 4．13．3 cDNA文库技术的局限性 | 第105页 |
| 4．4 工程菌生产的蛋白的复性与纯化 | 第105-106页 |
| 4．5 表达的昆虫几丁质酶大小探讨 | 第106页 |
| 4．6 关于半定量RT-PCR方法的探讨 | 第106-107页 |
| 4．7 关于表达的昆虫几丁质酶的杀虫活性探讨 | 第107-108页 |
| 5 结论 | 第108-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 附录 | 第122页 |
