中文摘要 | 第1-15页 |
英文摘要 | 第15-34页 |
第一部分 文献综述 | 第34-58页 |
1.1 昆虫病原真菌致病机理的研究进展 | 第34-44页 |
1.1.1 昆虫病原真菌感染寄主的基本过程 | 第35-36页 |
1.1.2 分生孢子的吸附和萌发 | 第36-37页 |
1.1.3 侵染结构的形成 | 第37-38页 |
1.1.4 穿透昆虫体壁 | 第38-42页 |
1.1.4.1 蛋白质降解酶 | 第39-41页 |
1.1.4.2 几丁质降解酶 | 第41-42页 |
1.1.4.3 昆虫病原真菌穿透寄主体壁时寄主的免疫反应 | 第42页 |
1.1.5 昆虫病原真菌在寄主血腔中生长 | 第42-44页 |
1.1.5.1 昆虫病原真菌克服寄主的免疫反应 | 第42-43页 |
1.1.5.2 在感染寄主的过程中昆虫病原真菌的能量代谢 | 第43-44页 |
1.1.6 小结 | 第44页 |
1.2 昆虫病原真菌的基因工程研究进展 | 第44-51页 |
1.2.1 昆虫病原真菌的遗传转化方法 | 第45-46页 |
1.2.1.1 选择标记基因 | 第45页 |
1.2.1.2 遗传转化方法 | 第45-46页 |
1.2.2 基因工程技术改良昆虫病原真菌的研究 | 第46-48页 |
1.2.2.1 提高昆虫病原真菌击倒害虫的速度 | 第47-48页 |
1.2.2.2 改变病原真菌的寄主范围 | 第48页 |
1.2.3 真菌杀虫剂的安全性问题 | 第48-50页 |
1.2.4 基因工程重组菌株的安全性问题及其解决方法 | 第50-51页 |
1.3 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展 | 第51-58页 |
1.3.1 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理 | 第53-54页 |
1.3.2 T-DNA在真菌中的存在方式 | 第54-56页 |
1.3.3 小结 | 第56-58页 |
第二部分 引言 | 第58-62页 |
2.1 研究的背景和意义 | 第58-61页 |
2.2 论文设计的思路框图 | 第61-62页 |
第三部分 球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的克隆及其上游调控序列的克隆与分析 | 第62-87页 |
3.1 材料 | 第62-65页 |
3.1.1 菌株 | 第62页 |
3.1.2 主要化学试剂 | 第62-63页 |
3.1.3 主要仪器设备 | 第63页 |
3.1.4 主要缓冲液配方 | 第63-64页 |
3.1.5 主要培养基配方 | 第64-65页 |
3.1.5.1 真菌和大肠杆菌用培养基 | 第64页 |
3.1.5.2 蝉蜕诱导培养基 | 第64-65页 |
3.1.5.3 构建cDNA文库用培养基 | 第65页 |
3.2 方法 | 第65-73页 |
3.2.1 Pr1蛋白酶活性的测定 | 第65页 |
3.2.2 球孢白僵菌Pr1类蛋白酶的诱导 | 第65页 |
3.2.3 丝状真菌DNA的提取 | 第65-66页 |
3.2.4 丝状真菌总RNA的提取 | 第66页 |
3.2.5 从琼脂糖上回收DNA片段 | 第66页 |
3.2.6 大肠杆菌DH5α的感受态制备和DNA转化 | 第66-67页 |
3.2.7 mRNA的纯化 | 第67页 |
3.2.8 cDNA文库的构建 | 第67-69页 |
3.2.8.1 cDNA的合成和加接头 | 第67-68页 |
3.2.8.2 含接头的cDNA与线性噬菌体DNA λ Excell EcoRⅠ/CIP的连接 | 第68页 |
3.2.8.3 λDNA的包装及转染 | 第68-69页 |
3.2.8.4 完整cDNA文库的生成与保存 | 第69页 |
3.2.9 噬菌体DNA(环型质粒)的释放 | 第69-70页 |
3.2.9.1 单噬菌体分离 | 第69页 |
3.2.9.2 从噬菌体中释放出环状质粒 | 第69-70页 |
3.2.10 RT-PCR法克隆类枯草杆菌蛋白酶基因的探针BbP | 第70页 |
3.2.11 cDNA文库的筛选 | 第70-71页 |
3.2.11.1 第一轮杂交 | 第70-71页 |
3.2.11.2 第二轮杂交 | 第71页 |
3.2.12 Southern杂交 | 第71-72页 |
3.2.12.1 转膜 | 第71-72页 |
3.2.12.2 杂交和洗膜 | 第72页 |
3.2.13 球孢白僵菌Pr1类蛋白酶的表达分析 | 第72页 |
3.2.14 球孢白僵菌YADE技术体系 | 第72-73页 |
3.2.14.1 酶切与连接 | 第72-73页 |
3.2.14.2 线性扩增 | 第73页 |
3.2.14.3 指数扩增 | 第73页 |
3.3 结果与分析 | 第73-84页 |
3.3.1 RNA的提取 | 第73页 |
3.3.2 诱导cDNA文库的构建 | 第73-74页 |
3.3.3 诱导cDNA文库插入片段长度分析 | 第74-75页 |
3.3.4 类枯草杆菌蛋白酶基因探针(BbP)的克隆 | 第75-76页 |
3.3.5 从诱导cDNA文库中筛选Pr1类蛋白酶基因的阳性克隆 | 第76-77页 |
3.3.6 球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的克隆与序列分析 | 第77-78页 |
3.3.7 gCDEP-1的Southern Blotting分析 | 第78-80页 |
3.3.8 CDEP-1的相似性分析 | 第80页 |
3.3.9 不同C/N源对CDEP-1表达的影响 | 第80-81页 |
3.3.10 YADE法克隆CDEP-1的上游调控序列 | 第81-84页 |
3.3.10.1 球孢白僵菌YADE体系中限制性内切酶的选用 | 第81-82页 |
3.3.10.2 CDEP-1基因上游调控序列的扩增及分析 | 第82-84页 |
3.4 讨论 | 第84-86页 |
3.5 小结 | 第86-87页 |
第四部分 球孢白僵菌几丁质酶基因的克隆与分析 | 第87-114页 |
第1章 内切几丁质酶Bbchit1的纯化、特性分析及其基因的克隆与分析 | 第87-107页 |
4.1.1 材料 | 第87-89页 |
4.1.1.1 菌株 | 第87页 |
4.1.1.2 主要化学试剂 | 第87页 |
4.1.1.3 主要仪器设备 | 第87页 |
4.1.1.4 常用贮存液和缓冲液 | 第87-89页 |
4.1.1.5 常用培养基 | 第89页 |
4.1.2 方法 | 第89-94页 |
4.1.2.1 胶体几丁质的制备 | 第89页 |
4.1.2.2 NAG标准曲线的制定 | 第89页 |
4.1.2.3 几丁质酶活性的测定 | 第89-90页 |
4.1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质条带的银染 | 第90页 |
4.1.2.5 蛋白质浓度的测定 | 第90-91页 |
4.1.2.6 SDS-PAGE测定蛋白质分子量 | 第91页 |
4.1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶薄层等电聚焦电泳(IEF-PAGE) | 第91页 |
4.1.2.8 球孢白僵菌几丁质酶的诱导 | 第91页 |
4.1.2.9 几丁质酶的纯化 | 第91-92页 |
4.1.2.9.1 制备粗酶液 | 第91-92页 |
4.1.2.9.2 Ultragel AcA54凝胶过滤层析 | 第92页 |
4.1.2.9.3 DEAE-Cellulose阴离子交换层析 | 第92页 |
4.1.2.10 几丁质酶N-端氨基酸序列的测定 | 第92-93页 |
4.1.2.10.1 蛋白质的电印渍及检测 | 第92页 |
4.1.2.10.2 蛋白质N-端序列测定 | 第92-93页 |
4.1.2.11 3'RACE | 第93-94页 |
4.1.2.11.1 简并引物设计 | 第93-94页 |
4.1.2.11.2 3'RACE | 第94页 |
4.1.2.12 YADE法扩增3'RACE产物的上游序列 | 第94页 |
4.1.3 结果与分析 | 第94-105页 |
4.1.3.1 NAG标准曲线的制定 | 第94-95页 |
4.1.3.2 球孢白僵菌几丁质酶的诱导 | 第95-96页 |
4.1.3.3 球孢白僵菌内切几丁质酶Bbchit1的纯化 | 第96-99页 |
4.1.3.4 内切几丁质酶Bbchit1的性质测定 | 第99-100页 |
4.1.3.4.1 内切几丁质酶Bbchit1的分子量测定 | 第99页 |
4.1.3.4.2 内切几丁质酶Bbchit1的等电点测定 | 第99-100页 |
4.1.3.5 内切几丁质酶Bbchit1的N-端氨基酸序列测定 | 第100页 |
4.1.3.6 内切几丁质酶基因Bbchit1的克隆与序列分析 | 第100-103页 |
4.1.3.7 Bbchit1与其它几丁质酶的相似性分析 | 第103页 |
4.1.3.8 Bbchit1的Southern杂交分析 | 第103-105页 |
4.1.4 讨论 | 第105页 |
4.1.5 小结 | 第105-107页 |
第2章 几丁质酶基因Bbchit2的克隆与分析 | 第107-114页 |
4.2.1 菌株 | 第107页 |
4.2.2 方法 | 第107-108页 |
4.2.2.1 克隆几丁质酶基因Bbchit2的思路 | 第107页 |
4.2.2.2 几丁质酶基因Bbchit2部分片段的克隆 | 第107页 |
4.2.2.3 利用YADE技术克隆完整的几丁质酶基因Bbchit2 | 第107-108页 |
4.2.2.4 采用RT-PCR技术得到几丁质酶基因Bbchit2的cDNA片段 | 第108页 |
4.2.3 结果与讨论 | 第108-113页 |
4.2.3.1 几丁质酶基因Bbchit2部分片段BbChiP的克隆 | 第108-109页 |
4.2.3.2 几丁质酶基因Bbchit2全长基因组序列、部分上游调控序列及其cDNA序列的克隆 | 第109-113页 |
4.2.3.3 Bbchit2与其它几丁质酶的相似性分析 | 第113页 |
4.2.4 小结 | 第113-114页 |
第五部分 根癌农杆菌介导球孢白僵菌遗传转化体系的建立 | 第114-136页 |
5.1 材料 | 第114-116页 |
5.1.1 菌株 | 第114页 |
5.1.2 质粒 | 第114-115页 |
5.1.3 主要化学试剂 | 第115页 |
5.1.4 常用培养基 | 第115页 |
5.1.5 主要缓冲液配方 | 第115-116页 |
5.2 方法 | 第116-119页 |
5.2.1 根癌农杆菌LBA4404感受态的制备及DNA转化 | 第116页 |
5.2.2 质粒DNA的提取 | 第116-117页 |
5.2.3 限制性内切酶部分酶切 | 第117页 |
5.2.4 筛选适于球孢白僵菌遗传转化的选择剂 | 第117页 |
5.2.5 根癌农杆菌介导球孢白僵菌遗传转化的过程 | 第117-118页 |
5.2.6 抗性菌落的PCR验证 | 第118页 |
5.2.7 利用YADE技术克隆转化子中与T-DNA相连的基因组序列 | 第118-119页 |
5.2.8 GUS染色 | 第119页 |
5.3 结果与分析 | 第119-133页 |
5.3.1 球孢白僵菌遗传转化筛选标记的确定 | 第119-120页 |
5.3.2 构建用于球孢白僵菌遗传转化的双元载体pBANF-bar | 第120-124页 |
5.3.3 根癌农杆菌介导球孢白僵菌遗传转化体系的建立 | 第124-126页 |
5.3.3.1 根癌农杆菌生长状态对转化效率的影响 | 第125页 |
5.3.3.2 乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响 | 第125-126页 |
5.3.3.3 共培养时间和分生孢子对转化效率的影响 | 第126页 |
5.3.4 PPT抗性菌落的PCR验证 | 第126-127页 |
5.3.5 PPT抗性菌落的Southern杂交验证 | 第127-128页 |
5.3.6 利用YADE技术扩增转化子中与T-DNA边界相连的序列 | 第128-129页 |
5.3.7 构建含报告基因GUS和选择标记基因bar的双元载体及其转化 | 第129-133页 |
5.4 讨论 | 第133-135页 |
5.5 小结 | 第135-136页 |
第六部分 组成性表达类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1创建球孢白僵菌高毒力菌株 | 第136-161页 |
6.1 材料 | 第136-137页 |
6.1.1 菌株 | 第136页 |
6.1.2 毒力检测用试虫 | 第136页 |
6.1.3 主要试剂 | 第136页 |
6.1.4 主要设备 | 第136页 |
6.1.5 常用缓冲液 | 第136页 |
6.1.6 培养基 | 第136-137页 |
6.2 方法 | 第137-139页 |
6.2.1 转基因菌株CDEP-1和Bbchit1的组成性表达分析 | 第137页 |
6.2.2 在昆虫体壁诱导培养基中转基因菌株CDEP-1和Bbchit1的表达 | 第137页 |
6.2.3 转基因菌株的Southern blotting验证 | 第137-138页 |
6.2.4 转基因菌株的PCR验证 | 第138页 |
6.2.5 毒力测定 | 第138页 |
6.2.6 致病菜青虫血淋巴中的蛋白质分析 | 第138页 |
6.2.7 转化子的产孢量、生长速度和孢子萌发中时的测定 | 第138-139页 |
6.3 结果与分析 | 第139-157页 |
6.3.1 组成性表达CDEP-1单价载体的构建 | 第139-144页 |
6.3.2 组成性表达CDEP-1双价载体的构建 | 第144页 |
6.3.3 组成性表达CDEP-1的转化子分析 | 第144-146页 |
6.3.4 构建组成性表达类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1的双价载体 | 第146-151页 |
6.3.5 类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1同时组成性表达的转化子分析 | 第151-152页 |
6.3.6 在蝉蜕诱导培养基中类枯草杆菌蛋白酶墓因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1同时组成性表达的转化子分析 | 第152-153页 |
6.3.7 毒力测定 | 第153-155页 |
6.3.8 被球孢白僵菌感染的菜青虫体内血淋巴中的蛋白质组分分析 | 第155-156页 |
6.3.9 CG5和CG7的产孢量、生长速度和萌发速度测定 | 第156-157页 |
6.4 讨论 | 第157-159页 |
6.5 小结 | 第159-161页 |
主要结论 | 第161-164页 |
参考文献 | 第164-176页 |
附录1 Genbank登录的基因序列及其简要介绍 | 第176-177页 |
附录2 文中缩写 | 第177-179页 |
附录3 学习期间主持、参加的项目和发表、撰写的文章及专利 | 第179-182页 |
致谢 | 第182-184页 |