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昆虫病原真菌降解寄主体壁酶基因的克隆及球孢白僵菌高毒力重组菌株的获得

中文摘要第1-15页
英文摘要第15-34页
第一部分 文献综述第34-58页
 1.1 昆虫病原真菌致病机理的研究进展第34-44页
  1.1.1 昆虫病原真菌感染寄主的基本过程第35-36页
  1.1.2 分生孢子的吸附和萌发第36-37页
  1.1.3 侵染结构的形成第37-38页
  1.1.4 穿透昆虫体壁第38-42页
   1.1.4.1 蛋白质降解酶第39-41页
   1.1.4.2 几丁质降解酶第41-42页
   1.1.4.3 昆虫病原真菌穿透寄主体壁时寄主的免疫反应第42页
  1.1.5 昆虫病原真菌在寄主血腔中生长第42-44页
   1.1.5.1 昆虫病原真菌克服寄主的免疫反应第42-43页
   1.1.5.2 在感染寄主的过程中昆虫病原真菌的能量代谢第43-44页
  1.1.6 小结第44页
 1.2 昆虫病原真菌的基因工程研究进展第44-51页
  1.2.1 昆虫病原真菌的遗传转化方法第45-46页
   1.2.1.1 选择标记基因第45页
   1.2.1.2 遗传转化方法第45-46页
  1.2.2 基因工程技术改良昆虫病原真菌的研究第46-48页
   1.2.2.1 提高昆虫病原真菌击倒害虫的速度第47-48页
   1.2.2.2 改变病原真菌的寄主范围第48页
  1.2.3 真菌杀虫剂的安全性问题第48-50页
  1.2.4 基因工程重组菌株的安全性问题及其解决方法第50-51页
 1.3 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展第51-58页
  1.3.1 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理第53-54页
  1.3.2 T-DNA在真菌中的存在方式第54-56页
  1.3.3 小结第56-58页
第二部分 引言第58-62页
 2.1 研究的背景和意义第58-61页
 2.2 论文设计的思路框图第61-62页
第三部分 球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的克隆及其上游调控序列的克隆与分析第62-87页
 3.1 材料第62-65页
  3.1.1 菌株第62页
  3.1.2 主要化学试剂第62-63页
  3.1.3 主要仪器设备第63页
  3.1.4 主要缓冲液配方第63-64页
  3.1.5 主要培养基配方第64-65页
   3.1.5.1 真菌和大肠杆菌用培养基第64页
   3.1.5.2 蝉蜕诱导培养基第64-65页
   3.1.5.3 构建cDNA文库用培养基第65页
 3.2 方法第65-73页
  3.2.1 Pr1蛋白酶活性的测定第65页
  3.2.2 球孢白僵菌Pr1类蛋白酶的诱导第65页
  3.2.3 丝状真菌DNA的提取第65-66页
  3.2.4 丝状真菌总RNA的提取第66页
  3.2.5 从琼脂糖上回收DNA片段第66页
  3.2.6 大肠杆菌DH5α的感受态制备和DNA转化第66-67页
  3.2.7 mRNA的纯化第67页
  3.2.8 cDNA文库的构建第67-69页
   3.2.8.1 cDNA的合成和加接头第67-68页
   3.2.8.2 含接头的cDNA与线性噬菌体DNA λ Excell EcoRⅠ/CIP的连接第68页
   3.2.8.3 λDNA的包装及转染第68-69页
   3.2.8.4 完整cDNA文库的生成与保存第69页
  3.2.9 噬菌体DNA(环型质粒)的释放第69-70页
   3.2.9.1 单噬菌体分离第69页
   3.2.9.2 从噬菌体中释放出环状质粒第69-70页
  3.2.10 RT-PCR法克隆类枯草杆菌蛋白酶基因的探针BbP第70页
  3.2.11 cDNA文库的筛选第70-71页
   3.2.11.1 第一轮杂交第70-71页
   3.2.11.2 第二轮杂交第71页
  3.2.12 Southern杂交第71-72页
   3.2.12.1 转膜第71-72页
   3.2.12.2 杂交和洗膜第72页
  3.2.13 球孢白僵菌Pr1类蛋白酶的表达分析第72页
  3.2.14 球孢白僵菌YADE技术体系第72-73页
   3.2.14.1 酶切与连接第72-73页
   3.2.14.2 线性扩增第73页
   3.2.14.3 指数扩增第73页
 3.3 结果与分析第73-84页
  3.3.1 RNA的提取第73页
  3.3.2 诱导cDNA文库的构建第73-74页
  3.3.3 诱导cDNA文库插入片段长度分析第74-75页
  3.3.4 类枯草杆菌蛋白酶基因探针(BbP)的克隆第75-76页
  3.3.5 从诱导cDNA文库中筛选Pr1类蛋白酶基因的阳性克隆第76-77页
  3.3.6 球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的克隆与序列分析第77-78页
  3.3.7 gCDEP-1的Southern Blotting分析第78-80页
  3.3.8 CDEP-1的相似性分析第80页
  3.3.9 不同C/N源对CDEP-1表达的影响第80-81页
  3.3.10 YADE法克隆CDEP-1的上游调控序列第81-84页
   3.3.10.1 球孢白僵菌YADE体系中限制性内切酶的选用第81-82页
   3.3.10.2 CDEP-1基因上游调控序列的扩增及分析第82-84页
 3.4 讨论第84-86页
 3.5 小结第86-87页
第四部分 球孢白僵菌几丁质酶基因的克隆与分析第87-114页
 第1章 内切几丁质酶Bbchit1的纯化、特性分析及其基因的克隆与分析第87-107页
  4.1.1 材料第87-89页
   4.1.1.1 菌株第87页
   4.1.1.2 主要化学试剂第87页
   4.1.1.3 主要仪器设备第87页
   4.1.1.4 常用贮存液和缓冲液第87-89页
   4.1.1.5 常用培养基第89页
  4.1.2 方法第89-94页
   4.1.2.1 胶体几丁质的制备第89页
   4.1.2.2 NAG标准曲线的制定第89页
   4.1.2.3 几丁质酶活性的测定第89-90页
   4.1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质条带的银染第90页
   4.1.2.5 蛋白质浓度的测定第90-91页
   4.1.2.6 SDS-PAGE测定蛋白质分子量第91页
   4.1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶薄层等电聚焦电泳(IEF-PAGE)第91页
   4.1.2.8 球孢白僵菌几丁质酶的诱导第91页
   4.1.2.9 几丁质酶的纯化第91-92页
    4.1.2.9.1 制备粗酶液第91-92页
    4.1.2.9.2 Ultragel AcA54凝胶过滤层析第92页
    4.1.2.9.3 DEAE-Cellulose阴离子交换层析第92页
   4.1.2.10 几丁质酶N-端氨基酸序列的测定第92-93页
    4.1.2.10.1 蛋白质的电印渍及检测第92页
    4.1.2.10.2 蛋白质N-端序列测定第92-93页
   4.1.2.11 3'RACE第93-94页
    4.1.2.11.1 简并引物设计第93-94页
    4.1.2.11.2 3'RACE第94页
   4.1.2.12 YADE法扩增3'RACE产物的上游序列第94页
  4.1.3 结果与分析第94-105页
   4.1.3.1 NAG标准曲线的制定第94-95页
   4.1.3.2 球孢白僵菌几丁质酶的诱导第95-96页
   4.1.3.3 球孢白僵菌内切几丁质酶Bbchit1的纯化第96-99页
   4.1.3.4 内切几丁质酶Bbchit1的性质测定第99-100页
    4.1.3.4.1 内切几丁质酶Bbchit1的分子量测定第99页
    4.1.3.4.2 内切几丁质酶Bbchit1的等电点测定第99-100页
   4.1.3.5 内切几丁质酶Bbchit1的N-端氨基酸序列测定第100页
   4.1.3.6 内切几丁质酶基因Bbchit1的克隆与序列分析第100-103页
   4.1.3.7 Bbchit1与其它几丁质酶的相似性分析第103页
   4.1.3.8 Bbchit1的Southern杂交分析第103-105页
  4.1.4 讨论第105页
  4.1.5 小结第105-107页
 第2章 几丁质酶基因Bbchit2的克隆与分析第107-114页
  4.2.1 菌株第107页
  4.2.2 方法第107-108页
   4.2.2.1 克隆几丁质酶基因Bbchit2的思路第107页
   4.2.2.2 几丁质酶基因Bbchit2部分片段的克隆第107页
   4.2.2.3 利用YADE技术克隆完整的几丁质酶基因Bbchit2第107-108页
   4.2.2.4 采用RT-PCR技术得到几丁质酶基因Bbchit2的cDNA片段第108页
  4.2.3 结果与讨论第108-113页
   4.2.3.1 几丁质酶基因Bbchit2部分片段BbChiP的克隆第108-109页
   4.2.3.2 几丁质酶基因Bbchit2全长基因组序列、部分上游调控序列及其cDNA序列的克隆第109-113页
   4.2.3.3 Bbchit2与其它几丁质酶的相似性分析第113页
  4.2.4 小结第113-114页
第五部分 根癌农杆菌介导球孢白僵菌遗传转化体系的建立第114-136页
 5.1 材料第114-116页
  5.1.1 菌株第114页
  5.1.2 质粒第114-115页
  5.1.3 主要化学试剂第115页
  5.1.4 常用培养基第115页
  5.1.5 主要缓冲液配方第115-116页
 5.2 方法第116-119页
  5.2.1 根癌农杆菌LBA4404感受态的制备及DNA转化第116页
  5.2.2 质粒DNA的提取第116-117页
  5.2.3 限制性内切酶部分酶切第117页
  5.2.4 筛选适于球孢白僵菌遗传转化的选择剂第117页
  5.2.5 根癌农杆菌介导球孢白僵菌遗传转化的过程第117-118页
  5.2.6 抗性菌落的PCR验证第118页
  5.2.7 利用YADE技术克隆转化子中与T-DNA相连的基因组序列第118-119页
  5.2.8 GUS染色第119页
 5.3 结果与分析第119-133页
  5.3.1 球孢白僵菌遗传转化筛选标记的确定第119-120页
  5.3.2 构建用于球孢白僵菌遗传转化的双元载体pBANF-bar第120-124页
  5.3.3 根癌农杆菌介导球孢白僵菌遗传转化体系的建立第124-126页
   5.3.3.1 根癌农杆菌生长状态对转化效率的影响第125页
   5.3.3.2 乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响第125-126页
   5.3.3.3 共培养时间和分生孢子对转化效率的影响第126页
  5.3.4 PPT抗性菌落的PCR验证第126-127页
  5.3.5 PPT抗性菌落的Southern杂交验证第127-128页
  5.3.6 利用YADE技术扩增转化子中与T-DNA边界相连的序列第128-129页
  5.3.7 构建含报告基因GUS和选择标记基因bar的双元载体及其转化第129-133页
 5.4 讨论第133-135页
 5.5 小结第135-136页
第六部分 组成性表达类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1创建球孢白僵菌高毒力菌株第136-161页
 6.1 材料第136-137页
  6.1.1 菌株第136页
  6.1.2 毒力检测用试虫第136页
  6.1.3 主要试剂第136页
  6.1.4 主要设备第136页
  6.1.5 常用缓冲液第136页
  6.1.6 培养基第136-137页
 6.2 方法第137-139页
  6.2.1 转基因菌株CDEP-1和Bbchit1的组成性表达分析第137页
  6.2.2 在昆虫体壁诱导培养基中转基因菌株CDEP-1和Bbchit1的表达第137页
  6.2.3 转基因菌株的Southern blotting验证第137-138页
  6.2.4 转基因菌株的PCR验证第138页
  6.2.5 毒力测定第138页
  6.2.6 致病菜青虫血淋巴中的蛋白质分析第138页
  6.2.7 转化子的产孢量、生长速度和孢子萌发中时的测定第138-139页
 6.3 结果与分析第139-157页
  6.3.1 组成性表达CDEP-1单价载体的构建第139-144页
  6.3.2 组成性表达CDEP-1双价载体的构建第144页
  6.3.3 组成性表达CDEP-1的转化子分析第144-146页
  6.3.4 构建组成性表达类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1的双价载体第146-151页
  6.3.5 类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1同时组成性表达的转化子分析第151-152页
  6.3.6 在蝉蜕诱导培养基中类枯草杆菌蛋白酶墓因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1同时组成性表达的转化子分析第152-153页
  6.3.7 毒力测定第153-155页
  6.3.8 被球孢白僵菌感染的菜青虫体内血淋巴中的蛋白质组分分析第155-156页
  6.3.9 CG5和CG7的产孢量、生长速度和萌发速度测定第156-157页
 6.4 讨论第157-159页
 6.5 小结第159-161页
主要结论第161-164页
参考文献第164-176页
附录1 Genbank登录的基因序列及其简要介绍第176-177页
附录2 文中缩写第177-179页
附录3 学习期间主持、参加的项目和发表、撰写的文章及专利第179-182页
致谢第182-184页

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