| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 1 前言 | 第7-22页 |
| 1．1 项目背景 | 第7-8页 |
| 1．2 链霉菌基因表达研究进展 | 第8-13页 |
| 1．2．1 链霉菌基因的转录与翻译 | 第8-9页 |
| 1．2．2 链霉菌基因克隆技术的发展 | 第9-10页 |
| 1．2．3 链霉菌的基因克隆类型 | 第10-13页 |
| 1．2．3．1 抗性基因的克隆 | 第10-11页 |
| 1．2．3．2 抗生素生物合成基因的克隆 | 第11页 |
| 1．2．3．3 通过基因重组产生新抗生素或杂合抗生素 | 第11-12页 |
| 1．2．3．4 调节基因和分化基因的克隆 | 第12页 |
| 1．2．3．5 链霉菌作为基因克隆的受体 | 第12-13页 |
| 1．3 透明颤菌血红蛋白及其基因的研究进展 | 第13-20页 |
| 1．3．1 透明颤菌血红蛋白的发现及其结构 | 第13-14页 |
| 1．3．2 透明颤菌血红蛋白基因（Vitreoscilla globin gene, Vgb）的克隆、表达与调控 | 第14-17页 |
| 1．3．3 透明颤菌血红蛋白的生理功能 | 第17-18页 |
| 1．3．4 透明颤菌血红蛋白的应用 | 第18-20页 |
| 1．3．4．1 在大肠杆菌中的应用 | 第18-19页 |
| 1．3．4．2 在霉菌中的应用 | 第19页 |
| 1．3．4．3 在酵母中的应用 | 第19页 |
| 1．3．4．4 在链霉菌中的应用 | 第19-20页 |
| 1．4 本工作的研究内容和创新之处 | 第20-22页 |
| 2 材料和方法 | 第22-29页 |
| 2．1 材料 | 第22-23页 |
| 2．1．1 菌种 | 第22页 |
| 2．1．2 质粒 | 第22页 |
| 2．1．3 酶和试剂 | 第22页 |
| 2．1．4 DNA标准品 | 第22页 |
| 2．1．5 培养基 | 第22-23页 |
| 2．1．5．1 大肠杆菌用L-肉汤培养基 | 第22页 |
| 2．1．5．2 金色链霉菌原生质体制备和再生用培养基 | 第22-23页 |
| 2．1．5．3 金色链霉菌生长用复合培养基 | 第23页 |
| 2．1．6 筛选用抗生素的浓度 | 第23页 |
| 2．2 方法 | 第23-27页 |
| 2．2．1 大肠杆菌质粒DNA的抽提-碱性裂解法 | 第23页 |
| 2．2．2 DNA的酶切 | 第23-24页 |
| 2．2．3 酶切片段回收-低熔点琼脂糖法 | 第24页 |
| 2．2．4 DNA的酶连 | 第24-25页 |
| 2．2．4．1 粘端连接反应体系 | 第24-25页 |
| 2．2．4．2 补平反应体系 | 第25页 |
| 2．2．4．3 平端连接反应体系 | 第25页 |
| 2．2．5 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl_2法）、外源质粒DNA的转化及克隆子的筛选 | 第25-26页 |
| 2．2．6 链霉菌原生质体的制备、转化、再生及克隆子的筛选 | 第26页 |
| 2．2．7 琼脂糖凝胶电泳 | 第26-27页 |
| 2．2．8 一氧化碳结合差光谱法 | 第27页 |
| 2．2．9 菌体量的测定 | 第27页 |
| 2．2．10 金霉素效价测定 | 第27页 |
| 2．3 培养条件 | 第27页 |
| 2．4 仪器 | 第27-29页 |
| 3 结果与讨论 | 第29-47页 |
| 3．1 含pBR322-Vgb质粒的大肠杆菌菌株的培养及质粒的提取 | 第29页 |
| 3．2 不同的样品制备方法对CO结合差光谱法测定结果的影响 | 第29-30页 |
| 3．3 pUC19-Vgb重组质粒的构建及在大肠杆菌JM109中的克隆和表达 | 第30-33页 |
| 3．3．1 构建方法 | 第30-32页 |
| 3．3．2 重组质粒DNA的转化及可疑克隆子的筛选 | 第32页 |
| 3．3．3 CO结合差光谱法验证可疑克隆子 | 第32-33页 |
| 3．3．4 琼脂糖凝胶电泳法验证可疑克隆子 | 第33页 |
| 3．3．5 pUC19-Vgb的稳定性 | 第33页 |
| 小结 | 第33页 |
| 3．4 pIJ699-pUC19-Vgb大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的构建及其在大肠杆菌JM109中的克隆和表达 | 第33-36页 |
| 3．4．1 构建方法 | 第33-35页 |
| 3．4．2 重组质粒的转化及可疑克隆子的筛选 | 第35页 |
| 3．4．3 琼脂糖凝胶电泳法验证可疑克隆子 | 第35页 |
| 3．4．4 CO结合差光谱法验证可疑克隆子 | 第35-36页 |
| 3．4．5 pIJ699-pUC19-Vgb的稳定性 | 第36页 |
| 小结 | 第36页 |
| 3．5 pIJ699-pUC19-Vgb穿梭质粒在金色链霉菌中的克隆和表达 | 第36-42页 |
| 3．5．1 金色链霉菌原生质体制备、转化及再生条件的优化 | 第36-40页 |
| 3．5．1．1 用于制备金色链霉菌原生质体的菌体生长培养基的优化 | 第36-38页 |
| 3．5．1．2 甘氨酸浓度和溶菌酶处理时间对原生质体制备的影响 | 第38页 |
| 3．5．1．3 原生质体再生培养基的选择 | 第38-39页 |
| 3．5．1．4 原生质体转化条件的优化 | 第39-40页 |
| 3．5．2 PIJ699-pUC19-Vgb转化金色链霉菌原生质体及可疑克隆子的筛选 | 第40页 |
| 3．5．3 克隆子的发酵特性研究 | 第40-41页 |
| 3．5．4 CO结合差光谱法验证成功克隆子 | 第41页 |
| 小结 | 第41-42页 |
| 3．6 含四环素启动子的pBR322-Vgb′质粒的构建及其在大肠杆菌JM109中的克隆和表达 | 第42-47页 |
| 3．6．1 pBR322-Vgb′质粒的构建 | 第42-43页 |
| 3．6．2 重组质粒DNA的转化及可疑克隆子的筛选 | 第43-44页 |
| 3．6．3 用四环素诱导四环素启动子表达VHb | 第44-45页 |
| 3．6．4 四环素启动子和天然启动子对Vgb的结构基因表达的影响 | 第45-46页 |
| 3．6．5 pBR322-Vgb′质粒的稳定性 | 第46页 |
| 小结 | 第46-47页 |
| 4 结论 | 第47-48页 |
| 5 建议 | 第48页 |
| 6 致谢 | 第48-49页 |
| 7 参考文献 | 第49-54页 |
