| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 第一章 前言 | 第9-22页 |
| ·荧光假单胞菌概述 | 第9-10页 |
| ·荧光假单胞菌形态与生化特征 | 第9-10页 |
| ·荧光假单胞菌的分布 | 第10页 |
| ·荧光假单胞菌引起的病害 | 第10页 |
| ·假单胞菌重金属耐受性和金属体内平衡 | 第10-16页 |
| ·金属体内平衡的维持 | 第11页 |
| ·金属的吸收和螯合作用 | 第11-12页 |
| ·类金属P型ATP酶 | 第12-13页 |
| ·金属外排作用 | 第13-15页 |
| ·金属体内平衡维持的调控蛋白 | 第15-16页 |
| ·微生物抗铜基因研究进展 | 第16-19页 |
| ·细菌抗铜基因及其作用方式 | 第17-18页 |
| ·耐铜基因的调节 | 第18-19页 |
| ·抗铜基因与致病性 | 第19页 |
| ·双元调控系统 | 第19-21页 |
| ·组氨酸蛋白激酶(HK) | 第20-21页 |
| ·反应调节蛋白(RR) | 第21页 |
| ·本研究的目的、意义 | 第21-22页 |
| 第二章 TSS抗铜基因操纵子的筛选与克隆 | 第22-37页 |
| ·实验材料 | 第22-24页 |
| ·实验方法 | 第24-32页 |
| ·TSS 3-6 kb DNA片段的文库构建 | 第24-28页 |
| ·TSS基因组DNA的提取 | 第24-25页 |
| ·TSS基因组DNA Sau3AI酶切 | 第25页 |
| ·目的片段的胶回收 | 第25-26页 |
| ·pBU载体的酶切及去磷酸化处理 | 第26页 |
| ·载体与目的片段的连接 | 第26-27页 |
| ·重组质粒的转化 | 第27-28页 |
| ·阳性克隆的酶切鉴定和测序 | 第28页 |
| ·TSS染色体步移文库的构建 | 第28页 |
| ·TSS抗铜基因簇copRSCD基因的克隆 | 第28-29页 |
| ·copCD共转录的验证 | 第29-32页 |
| ·TSS RNA提取 | 第29-30页 |
| ·RNA 的DNA污染检测 | 第30-31页 |
| ·cDNA的合成 | 第31-32页 |
| ·copCD共转录RT-PCR验证 | 第32页 |
| ·实验结果 | 第32-35页 |
| ·基因组DNA提取结果 | 第32页 |
| ·TSS 3-6 kb DNA片段的文库构建及其抗铜基因的筛选 | 第32-33页 |
| ·TSS染色体步移文库的构建 | 第33-34页 |
| ·TSS抗铜基因簇copRSCD基因的克隆 | 第34页 |
| ·TSS RNA 提取及RT-PCR | 第34-35页 |
| ·copRSCD邻近基因排布 | 第35页 |
| ·分析与讨论 | 第35-37页 |
| 第三章 TSS抗铜基因copRSCD的敲除及抗铜性分析 | 第37-57页 |
| ·实验材料 | 第37-38页 |
| ·实验方法 | 第38-47页 |
| ·copR和copC的缺失 | 第38-42页 |
| ·引物设计 | 第38-39页 |
| ·Overlap PCR产生copR和copC缺失片段 | 第39-40页 |
| ·重组自杀质粒的构建 | 第40-41页 |
| ·TSS与自杀质粒的菌株接合转移 | 第41-42页 |
| ·二次交换及缺陷株筛选 | 第42页 |
| ·copS、copD和orf342 的插入失活 | 第42-44页 |
| ·交换区目的片段的克隆 | 第42页 |
| ·目的片段的T4 多聚核苷酸激酶处理 | 第42页 |
| ·目的片段与自杀性载体p7T连接、转化 | 第42-43页 |
| ·自杀性重组质粒与TSS的接合转移 | 第43-44页 |
| ·copR和copC过量表达菌株的构建 | 第44-45页 |
| ·目的基因的克隆 | 第44页 |
| ·目的基因与中间载体pBT的连接 | 第44页 |
| ·copR和copC过量表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·copR和copC过量表达菌株的构建 | 第45页 |
| ·TSSRM和TSSCM的互补菌株的构建 | 第45页 |
| ·抗铜MIC值测定 | 第45页 |
| ·生长状况分析 | 第45-47页 |
| ·实验结果 | 第47-53页 |
| ·Overlap PCR产生copR和copC缺失片段 | 第47页 |
| ·重组自杀质粒p7TSRM和p7TSCM的构建 | 第47-48页 |
| ·copR和copC缺陷株筛选 | 第48-49页 |
| ·copS、copD和orf342 的插入失活 | 第49-50页 |
| ·copR和copC过量表达菌株的构建 | 第50-51页 |
| ·TSSRM和TSSCM的互补菌株的构建 | 第51页 |
| ·抗铜MIC值测定 | 第51页 |
| ·生长状况分析 | 第51-53页 |
| ·分析与讨论 | 第53-57页 |
| ·基因缺失突变 | 第53页 |
| ·copS、copD和orf342 的插入失活 | 第53-54页 |
| ·copR和copC过量表达菌株的构建 | 第54页 |
| ·TSS 及其衍生菌株的抗铜性 | 第54-56页 |
| ·TSS 及其衍生菌株的生长状况 | 第56-57页 |
| 第四章 抗铜操纵子表达调控分析 | 第57-86页 |
| ·实验材料 | 第59-60页 |
| ·实验方法 | 第60-74页 |
| ·pBTR对copC和copR的启动子的调控 | 第60-61页 |
| ·c opC和copR启动子的克隆 | 第60页 |
| ·重组质粒pSD601 和pSD210 的构建 | 第60页 |
| ·pBTR与启动子的相互作用 | 第60-61页 |
| ·启动子活性检测 | 第61页 |
| ·启动子D601 和D210 体内活性研究 | 第61-64页 |
| ·载体p181 的构建 | 第61-62页 |
| ·pJT601 和pJT210 的构建 | 第62-63页 |
| ·D601 和D210 体内活性测定 | 第63-64页 |
| ·Cu对copC和copR的诱导表达 | 第64-66页 |
| ·细胞的收集 | 第64-65页 |
| ·RNA提取 | 第65页 |
| ·cDNA的合成 | 第65页 |
| ·Realtime PCR | 第65-66页 |
| ·其他金属离子对copC和copR的诱导表达 | 第66页 |
| ·CopR对copC的表达调控 | 第66页 |
| ·CopR对copR的表达调控 | 第66页 |
| ·CopR与D601 和D210 的相互作用 | 第66-72页 |
| ·copR基因的克隆 | 第66-67页 |
| ·CopR原核诱导表达载体的构建 | 第67页 |
| ·CopR诱导表达菌株的构建 | 第67页 |
| ·CopR蛋白诱导表达 | 第67-68页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第68-70页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第70-72页 |
| ·凝胶滞缓实验(EMSA) | 第72页 |
| ·CopR缺失突变 | 第72-74页 |
| ·copR突变基因的克隆 | 第72-73页 |
| ·CopR缺失突变的功能鉴定 | 第73页 |
| ·TSS/pJC104 和TSSRM/pJC104 的构建 | 第73页 |
| ·TSS/pJC104 和TSSRM/pJC104 生长状况的分析 | 第73页 |
| ·TSS/pJC104 和TSSRM/pJC104 对copC的表达调控 | 第73-74页 |
| ·实验结果 | 第74-82页 |
| ·CopR对copC和copR的启动子的作用 | 第74-75页 |
| ·启动子D601 和D210 体内活性研究 | 第75页 |
| ·Cu对copC和copR的诱导表达 | 第75-78页 |
| ·CopR调控copC和copR的表达 | 第78-79页 |
| ·CopR与D601 和D210 的相互作用 | 第79-81页 |
| ·CopR缺失突变株的功能鉴定 | 第81-82页 |
| ·分析与讨论 | 第82-86页 |
| ·CopR对D601 和D210 活性 | 第82页 |
| ·启动子D601 和D210 体内活性研究 | 第82页 |
| ·copC和copR转录水平的研究 | 第82-84页 |
| ·CopR与D601 和D210 的相互作用 | 第84页 |
| ·CopR缺失突变 | 第84-86页 |
| 第五章 抗铜基因对TSS致病性分析 | 第86-91页 |
| ·实验材料 | 第86页 |
| ·实验方法 | 第86-88页 |
| ·copR缺失及过量表达菌株对牙鲆致病力的比较 | 第86页 |
| ·质粒的稳定性检验 | 第86-87页 |
| ·copR缺失及过量表达菌株生物膜形成能力的比较 | 第87-88页 |
| ·实验结果 | 第88-89页 |
| ·分析与讨论 | 第89-91页 |
| 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-99页 |
| 博士期间发表的论文和申请的专利 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100页 |
