| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 前言 | 第15-43页 |
| 1.1 心脏的发生及调控机制 | 第15-23页 |
| 1.1.1 心脏的结构与功能 | 第15-23页 |
| 1.1.1.1 心脏的发生及调控 | 第15-17页 |
| 1.1.2.1 心管、心脏循环的发生与调控 | 第17-18页 |
| 1.1.2.2 心室的发生及调控 | 第18页 |
| 1.1.2.3 心房的发生及调控 | 第18-19页 |
| 1.1.2.4 心肌增殖及调控 | 第19页 |
| 1.1.2.5 心脏瓣膜的发生及调控 | 第19页 |
| 1.1.2.6 心脏与血管的连接 | 第19-20页 |
| 1.1.2.7 心脏疾病及治疗方法 | 第20-23页 |
| 1.2 胚胎干细胞向心肌细胞的分化及调控 | 第23-26页 |
| 1.2.1 胚胎干细胞的概况 | 第23-24页 |
| 1.2.2 胚胎干细胞向心肌细胞的分化过程 | 第24-26页 |
| 1.3 RNA结合蛋白(RNA BNDING PROTEIN) | 第26-36页 |
| 1.3.1 RNA结合蛋白的结构和功能 | 第26-27页 |
| 1.3.2 RBM24基因 | 第27-34页 |
| 1.3.2.1 RBM24基因的结构 | 第28-30页 |
| 1.3.2.2 RBM24基因的功能 | 第30页 |
| 1.3.2.3 RBM24基因调控MicroRNA | 第30页 |
| 1.3.2.4 RBM24调控斑马鱼和小鼠的心脏发育 | 第30-32页 |
| 1.3.2.5 RBM24调控ESC分化 | 第32-33页 |
| 1.3.2.6 RBM24可作为剪接因子发挥功能 | 第33-34页 |
| 1.3.3 RBM24基因与其他基因的相互作用 | 第34-36页 |
| 1.3.3.1 RBM24基因与p21基因 | 第34-35页 |
| 1.3.3.2 RBM24基因与p63基因 | 第35页 |
| 1.3.3.3 RBM24基因与MYOG基因 | 第35-36页 |
| 1.4 Crisprcas9 | 第36-43页 |
| 1.4.1 现阶段的基因编辑技术 | 第37页 |
| 1.4.2 CRISPR-Cas9的发现与发展 | 第37-38页 |
| 1.4.3 Ⅱ型CRISPR-Cas9系统 | 第38-39页 |
| 1.4.4 由CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术 | 第39页 |
| 1.4.5 引导RNA的选择 | 第39-40页 |
| 1.4.6 目标DNA序列的设计 | 第40页 |
| 1.4.7 Cas9与gRNA转染细胞策略 | 第40-41页 |
| 1.4.8 提高目标特异性的策略 | 第41页 |
| 1.4.9 CRISPR-Cas9基因组编辑技术的应用与拓展 | 第41-43页 |
| 第二章 材料与方法 | 第43-67页 |
| 2.1 实验材料 | 第43-44页 |
| 2.1.1 细胞株 | 第43页 |
| 2.1.2 感受态和表达载体质粒 | 第43页 |
| 2.1.3 实验小鼠 | 第43页 |
| 2.1.4 PCR和qPCR引物 | 第43-44页 |
| 2.2 主要仪器和耗材 | 第44-45页 |
| 2.3 主要试剂 | 第45-48页 |
| 2.4 实验内容与方法 | 第48-67页 |
| 2.4.1 真核基因表达质粒的构建 | 第48-56页 |
| 2.4.1.1 细胞的总RNA提取 | 第48-49页 |
| 2.4.1.2 RNA反转录合成cDNA模板 | 第49页 |
| 2.4.1.3 以cDNA为模板扩增目的基因 | 第49-50页 |
| 2.4.1.4 PCR产物琼脂糖凝胶跑胶电泳 | 第50-51页 |
| 2.4.1.5 从PCR产物中回收目的片段 | 第51-52页 |
| 2.4.1.6 DNA限制性内切酶酶切DNA片段和载体片段 | 第52页 |
| 2.4.1.7 从酶切产物中回收DNA | 第52-53页 |
| 2.4.1.8 载体去磷酸化处理 | 第53-54页 |
| 2.4.1.9 目的片段和载体的连接 | 第54页 |
| 2.4.1.10 连接物的转化 | 第54-55页 |
| 2.4.1.11 质粒小量提取 | 第55-56页 |
| 2.4.2 原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的制备 | 第56-57页 |
| 2.4.3 细胞培养 | 第57-60页 |
| 2.4.3.1 细胞复苏 | 第57-58页 |
| 2.4.3.1 细胞传代 | 第58-59页 |
| 2.4.3.2 细胞冻存 | 第59页 |
| 2.4.3.3 细胞计数 | 第59-60页 |
| 2.4.3.5 小鼠胚胎干细胞mESCs的分化 | 第60页 |
| 2.4.4 细胞转染 | 第60-62页 |
| 2.4.4.1 PEI转染法 | 第60-61页 |
| 2.4.4.2 电转染法 | 第61-62页 |
| 2.4.5 Western Blot免疫印迹分析 | 第62-64页 |
| 2.4.5.1 细胞内总蛋白提取 | 第62页 |
| 2.4.5.2 BCA法检测蛋白浓度 | 第62-63页 |
| 2.4.5.3 Western Blot免疫印迹 | 第63-64页 |
| 2.4.6 细胞免疫荧光染色 | 第64-65页 |
| 2.4.7 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) | 第65-66页 |
| 2.4.8 RNA-seq分析 | 第66-67页 |
| 第三章 结果分析 | 第67-86页 |
| 3.1 双gRNA引导的人源RBM24的敲除 | 第67-69页 |
| 3.2 cas9的构建 | 第69-70页 |
| 3.3 载体的测序以及对HEK-293FT转染成功 | 第70-71页 |
| 3.4 对HEK-293T细胞RNA结合蛋白RBM24的exon1敲除检测 | 第71-73页 |
| 3.5 对敲除的片段进行测序验证 | 第73-74页 |
| 3.6 构建适用于小鼠胚胎干细胞敲除RBM24的PX458M (PX459M) | 第74-75页 |
| 3.7 探究小鼠胚胎干细胞的分化过程中RBM24的表达变化情况 | 第75-76页 |
| 3.8 通过流式细胞术分选Cas9阳性细胞 | 第76-77页 |
| 3.9 对分选出细胞进行初步的鉴定 | 第77-79页 |
| 3.10 对流式细胞术分选出来的细胞进一步纯化 | 第79-80页 |
| 3.11 对敲除后的细胞进行后续干性检测 | 第80-82页 |
| 3.12 敲除RNA结合蛋白RBM24后对小鼠胚胎干细胞分化的影响 | 第82-83页 |
| 3.13 RBM24敲除的小鼠胚胎心脏数据分析 | 第83-86页 |
| 第四章 结果讨论 | 第86-89页 |
| 第五章 结论 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
