| 摘要 | 第8-9页 |
| 前言 | 第9-10页 |
| 文献综述 | 第10-17页 |
| 1 真核生物基因转录调控 | 第10-12页 |
| 1.1 真核生物基因转录调控的顺式作用元件 | 第10-11页 |
| 1.2 真核生物基因转录调控的反式作用因子 | 第11-12页 |
| 2 Myomaker的研究进展 | 第12-14页 |
| 2.1 Myomaker的结构特点 | 第12页 |
| 2.2 Myomaker的生物学功能和表达调控 | 第12-13页 |
| 2.3 Myomaker等成肌细胞融合相关基因的研究进展 | 第13-14页 |
| 3 Smad蛋白与肌肉发育的关系 | 第14-17页 |
| 3.1 Smad蛋白家族 | 第14-15页 |
| 3.2 Smad3与肌肉发育的关系 | 第15-17页 |
| 试验一 SMAD元件突变型绵羊MyomakerPro~(SMADM)-EGFP真核表达载体的构建 | 第17-28页 |
| 1 试验材料 | 第17-18页 |
| 1.1 试验菌株和质粒载体 | 第17页 |
| 1.2 试验试剂与耗材 | 第17页 |
| 1.3 试验仪器 | 第17-18页 |
| 1.4 主要试剂及缓冲液的配制 | 第18页 |
| 2 试验方法 | 第18-24页 |
| 2.1 PCR扩增 | 第18-19页 |
| 2.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第19-20页 |
| 2.3 目的片段的胶回收 | 第20页 |
| 2.4 回收片段与载体的双酶切 | 第20-21页 |
| 2.5 目的片段与载体的连接 | 第21页 |
| 2.6 连接产物的转化 | 第21页 |
| 2.7 重组质粒的扩大培养 | 第21页 |
| 2.8 质粒小提 | 第21-22页 |
| 2.9 重组质粒的酶切及测序鉴定 | 第22-23页 |
| 2.10 绵羊Myomaker基因5'调控区SMAD元件突变型真核表达载体MyomakerPro~(SMADM)-EGFP的构建过程 | 第23-24页 |
| 3 试验结果 | 第24-27页 |
| 3.1 目的片段PCR扩增结果 | 第24-26页 |
| 3.2 酶切鉴定结果 | 第26页 |
| 3.3 测序后序列比对结果 | 第26-27页 |
| 4 小结 | 第27-28页 |
| 试验二 SMAD元件在绵羊Myomaker基因转录调控中的作用 | 第28-41页 |
| 1 试验材料 | 第28-29页 |
| 1.1 试验质粒载体、细胞 | 第28页 |
| 1.2 试验试剂与耗材 | 第28页 |
| 1.3 试验仪器 | 第28-29页 |
| 1.4 主要试剂及缓冲液的配制 | 第29页 |
| 2 试验方法 | 第29-36页 |
| 2.1 无内毒素质粒DNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.2 C2C12成肌细胞的复苏 | 第30页 |
| 2.3 C2C12成肌细胞的传代 | 第30-31页 |
| 2.4 C2C12成肌细胞的冻存 | 第31页 |
| 2.5 C2C12成肌细胞的转染 | 第31-32页 |
| 2.6 C2C12成肌细胞RNA提取 | 第32页 |
| 2.7 反转录和荧光定量PCR | 第32-33页 |
| 2.8 组织核蛋白的提取 | 第33-34页 |
| 2.9 探针的合成与标记 | 第34页 |
| 2.10 EMSA结合实验、电泳及转膜 | 第34-36页 |
| 2.11 紫外交联反应及检测生物素标记探针 | 第36页 |
| 3 实验结果 | 第36-40页 |
| 3.1 细胞总RNA提取结果 | 第36-37页 |
| 3.2 基因扩增动力学曲线 | 第37页 |
| 3.3 SMAD元件突变对绵羊Myomaker基因5'调控区转录调控活性的影响 | 第37-39页 |
| 3.4 SMAD3元件与肌肉组织相应因子结合的EMSA鉴定结果 | 第39-40页 |
| 4 小结 | 第40-41页 |
| 试验三 Smad3基因过表达/沉默对绵羊Myomaker基因5'调控区转录调控活性的影响 | 第41-53页 |
| 1 试验材料 | 第41页 |
| 1.1 质粒载体和细胞 | 第41页 |
| 1.2 分子和细胞试验生化试剂 | 第41页 |
| 1.3 主要仪器与设备 | 第41页 |
| 1.4 主要试剂及缓冲液的配制 | 第41页 |
| 2 试验方法 | 第41-43页 |
| 2.1 无内毒素质粒DNA提取 | 第41页 |
| 2.2 成肌细胞的传代 | 第41页 |
| 2.3 C2C12成肌细胞的传代 | 第41-42页 |
| 2.4 C2C12成肌细胞的转染 | 第42页 |
| 2.5 C2C12成肌细胞的RNA提取 | 第42页 |
| 2.6 反转录和荧光定量PCR | 第42页 |
| 2.7 细胞核蛋白的提取 | 第42-43页 |
| 2.8 探针的合成与标记 | 第43页 |
| 2.9 细胞EMSA结合实验、电泳及转膜 | 第43页 |
| 2.10 紫外交联反应及检测生物素标记探针 | 第43页 |
| 3 实验结果 | 第43-52页 |
| 3.1 Smad3基因沉默位点的筛选 | 第43-45页 |
| 3.2 Smad3基因过表达对绵羊Myomaker基因5'调控区转录调控活性的影响 | 第45-48页 |
| 3.3 Smad3基因沉默对绵羊Myomaker基因5'调控区转录调控活性的影响 | 第48-51页 |
| 3.4 Smad3基因过表达对细胞核蛋白与SMAD3元件结合的影响 | 第51-52页 |
| 4 小结 | 第52-53页 |
| 讨论 | 第53-56页 |
| 1 SMAD元件对绵羊Myomaker基因转录调控的影响 | 第53页 |
| 2 过表迗Smad3基因对绵羊Myomaker基因转录调控活性的影响 | 第53-54页 |
| 3 干扰Smad3基因对绵羊Myomaker基因转录调控活性的影响 | 第54-56页 |
| 结论 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-62页 |
| Abstract | 第62页 |
| 附录 | 第64-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
