| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词表 | 第11-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-50页 |
| 1.1 引言 | 第19-20页 |
| 1.2 脂肪酶概述 | 第20-26页 |
| 1.2.1 脂肪酶的催化机理 | 第20页 |
| 1.2.2 脂肪酶来源 | 第20-21页 |
| 1.2.3 脂肪酶的异源表达 | 第21-24页 |
| 1.2.3.1 原核表达系统 | 第22页 |
| 1.2.3.2 酵母表达系统 | 第22-23页 |
| 1.2.3.3 丝状真菌表达系统 | 第23-24页 |
| 1.2.4 脂肪酶的应用 | 第24-26页 |
| 1.2.4.1 脂肪酶在食品加工中的应用 | 第24页 |
| 1.2.4.2 脂肪酶在医药领域中的应用 | 第24-25页 |
| 1.2.4.3 脂肪酶在洗涤剂中的应用 | 第25页 |
| 1.2.4.4 脂肪酶在合成生物柴油中的应用 | 第25页 |
| 1.2.4.5 脂肪酶在其它领域的应用 | 第25-26页 |
| 1.3 里氏木霉的转录调控 | 第26-34页 |
| 1.3.1 氏木霉对不溶诱导物的识别 | 第27-28页 |
| 1.3.2 里氏木霉主要的转录调控因子 | 第28-31页 |
| 1.3.2.1 XYR1 | 第28-29页 |
| 1.3.2.2 CRE1 | 第29-30页 |
| 1.3.2.3 ACE1 | 第30页 |
| 1.3.2.4 ACE2 | 第30-31页 |
| 1.3.2.5 HAP2/3/5 | 第31页 |
| 1.3.3 里氏木霉主要纤维素酶基因启动子的调控 | 第31-32页 |
| 1.3.4 里氏木霉主要半纤维素酶基因启动子的调控 | 第32-34页 |
| 1.4 里氏木霉表达体系的构建 | 第34-41页 |
| 1.4.1 里氏木霉表达载体的构建 | 第34-36页 |
| 1.4.1.1 启动子 | 第34-35页 |
| 1.4.1.2 选择标记 | 第35-36页 |
| 1.4.2 里氏木霉转化体系的构建 | 第36-41页 |
| 1.4.2.1 原生质体转化 | 第37-38页 |
| 1.4.2.2 ATMT | 第38-40页 |
| 1.4.2.3 BP | 第40页 |
| 1.4.2.4 BT | 第40-41页 |
| 1.5 异源蛋白在里氏木霉中的表达 | 第41-45页 |
| 1.6 提高蛋白表达水平的手段 | 第45-48页 |
| 1.6.1 整合位点和拷贝数 | 第45页 |
| 1.6.2 信号序列 | 第45-46页 |
| 1.6.3 密码子优化 | 第46页 |
| 1.6.4 融合表达 | 第46-47页 |
| 1.6.5 蛋白质量控制 | 第47-48页 |
| 1.7 本课题的研究思路及拟研究内容 | 第48-50页 |
| 第二章 嗜热踝节菌脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第50-68页 |
| 2.1 引言 | 第50页 |
| 2.2 材料与方法 | 第50-57页 |
| 2.2.1 质粒与菌株 | 第50-51页 |
| 2.2.2 主要实验仪器 | 第51-52页 |
| 2.2.3 具酶与试剂 | 第52页 |
| 2.2.4 培养基 | 第52-53页 |
| 2.2.4.1 大肠杆菌培养基 | 第52页 |
| 2.2.4.2 毕赤酵母培养基 | 第52-53页 |
| 2.2.5 嗜热踝节菌脂肪酶ttl基因的优化与重组质粒构建 | 第53页 |
| 2.2.6 大肠杆菌的转化 | 第53-54页 |
| 2.2.6.1 大肠杆菌感受态的制备 | 第53-54页 |
| 2.2.6.2 大肠杆菌的转化与转化子筛选 | 第54页 |
| 2.2.6.3 重组质粒的扩增、提取与纯化 | 第54页 |
| 2.2.6.4 重组质粒的验证 | 第54页 |
| 2.2.7 毕赤酵母GS115的转化 | 第54-56页 |
| 2.2.7.1 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第54-55页 |
| 2.2.7.2 毕赤酵母细胞的电转化 | 第55页 |
| 2.2.7.3 重组毕赤酵母转化子的筛选 | 第55页 |
| 2.2.7.4 重组毕赤酵母基因组DNA的提取 | 第55-56页 |
| 2.2.7.5 重组毕赤酵母转化子的PCR验证 | 第56页 |
| 2.2.8 重组毕赤酵母转化子的诱导表达 | 第56页 |
| 2.2.9 测定方法 | 第56-57页 |
| 2.2.9.1 脂肪酶活力的测定 | 第56页 |
| 2.2.9.2 大肠杆菌菌体浓度的测定 | 第56页 |
| 2.2.9.3 毕赤酵母细胞浓度的测定 | 第56-57页 |
| 2.2.9.4 蛋白质电泳(SDS-PAGE) | 第57页 |
| 2.2.9.5 发酵液中可溶性蛋白的测定 | 第57页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第57-66页 |
| 2.3.1 嗜热踝节菌脂肪酶基因的分析及其优化 | 第57-59页 |
| 2.3.2 毕赤酵母表达载体的构建与验证 | 第59-60页 |
| 2.3.3 重组毕赤酵母转化子的筛选 | 第60页 |
| 2.3.4 重组毕赤酵母转化子的PCR验证 | 第60-61页 |
| 2.3.5 脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第61-62页 |
| 2.3.6 重组毕赤酵母产酶条件的优化 | 第62-65页 |
| 2.3.6.1 甲醇浓度对重组毕赤酵母产脂肪酶的影响 | 第62-63页 |
| 2.3.6.2 初始毕赤酵母浓度对其产脂肪酶的影响 | 第63-64页 |
| 2.3.6.3 初始pH对重组毕赤酵母产脂肪酶的影响 | 第64-65页 |
| 2.3.7 重组毕赤酵母产酶进程 | 第65-66页 |
| 2.3.8 重组毕赤酵母发酵液的蛋白电泳 | 第66页 |
| 2.4 小结 | 第66-68页 |
| 第三章 嗜热踝节菌脂肪酶基因在里氏木霉中随机整合表达 | 第68-94页 |
| 3.1 引言 | 第68页 |
| 3.2 材料与方法 | 第68-77页 |
| 3.2.1 质粒与菌株 | 第68-69页 |
| 3.2.2 主要工具酶与试剂 | 第69页 |
| 3.2.3 主要实验仪器 | 第69-70页 |
| 3.2.4 培养基 | 第70-71页 |
| 3.2.5 表达载体的构建 | 第71-73页 |
| 3.2.5.1 里氏木霉基因组DNA的提取 | 第71页 |
| 3.2.5.2 PCR操作方法 | 第71页 |
| 3.2.5.3 重组质粒PMD-TTL的构建 | 第71-72页 |
| 3.2.5.4 重组质粒pUC-PstT的构建 | 第72-73页 |
| 3.2.5.5 重组质粒pCB-H-PstT的构建 | 第73页 |
| 3.2.6 里氏木霉原生质体转化 | 第73-74页 |
| 3.2.6.1 里氏木霉原生质体的制备 | 第73-74页 |
| 3.2.6.2 里氏木霉原生质体的转化 | 第74页 |
| 3.2.7 质粒转入农杆菌 | 第74-75页 |
| 3.2.7.1 农杆菌的培养 | 第74页 |
| 3.2.7.2 农杆菌感受态细胞的制备 | 第74页 |
| 3.2.7.3 冻融法转化农杆菌 | 第74-75页 |
| 3.2.7.4 重组农杆菌的鉴定 | 第75页 |
| 3.2.8 农杆菌介导转化里氏木霉 | 第75页 |
| 3.2.8.1 里氏木霉孢子液的制备 | 第75页 |
| 3.2.8.2 农杆菌介导转化 | 第75页 |
| 3.2.9 重组里氏木霉的筛选 | 第75页 |
| 3.2.10 重组里氏木霉传代稳定性验证 | 第75-76页 |
| 3.2.11 重组里氏木霉转化子的摇瓶产酶实验 | 第76页 |
| 3.2.12 测定方法 | 第76-77页 |
| 3.2.12.1 脂肪酶活力测定 | 第76页 |
| 3.2.12.2 农杆菌浓度的测定 | 第76页 |
| 3.2.12.3 转化子菌落直径的测定 | 第76页 |
| 3.2.12.4 转化效率的计算 | 第76页 |
| 3.2.12.5 蛋白质电泳(SDS-PAGE) | 第76-77页 |
| 3.2.12.6 发酵液中可溶性蛋白的测定 | 第77页 |
| 3.2.12.7 还原糖含量测定 | 第77页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第77-92页 |
| 3.3.1 嗜热踝节菌脂肪酶基因序列的优化 | 第77-79页 |
| 3.3.2 里氏木霉表达载体的构建与验证 | 第79-80页 |
| 3.3.3 原生质体介导转化体系(PMT)的构建 | 第80-83页 |
| 3.3.3.1 孢子预萌发对PMT转化效率的影响 | 第80-81页 |
| 3.3.3.2 酶解时间对PMT转化效率的影响 | 第81-82页 |
| 3.3.3.3 原生质体浓度对PMT转化效率的影响 | 第82-83页 |
| 3.3.4 农杆菌介导转化体系(ATMT)的构建 | 第83-87页 |
| 3.3.4.1 农杆菌种类对ATMT转化效率的影响 | 第83页 |
| 3.3.4.2 农杆菌浓度对ATMT转化效率的影响 | 第83-84页 |
| 3.3.4.3 共培养pH对ATMT转化效率的影响 | 第84-85页 |
| 3.3.4.4 共培养温度对ATMT转化效率的影响 | 第85页 |
| 3.3.4.5 乙酰丁香酮(AS)浓度对ATMT转化效率的影响 | 第85-86页 |
| 3.3.4.6 孢子预萌发对ATMT转化效率的影响 | 第86-87页 |
| 3.3.5 两种转化体系的比较分析 | 第87-88页 |
| 3.3.6 重组里氏木霉转化子的筛选 | 第88-89页 |
| 3.3.7 重组里氏木霉转化子的验证 | 第89-90页 |
| 3.3.8 重组里氏木霉转化子摇瓶产异源脂肪酶 | 第90-91页 |
| 3.3.9 重组里氏木霉发酵液的SDS-PAGE分析 | 第91-92页 |
| 3.4 小结 | 第92-94页 |
| 第四章 嗜热踝节菌脂肪酶基因在里氏木霉中定向整合表达 | 第94-112页 |
| 4.1 引言 | 第94页 |
| 4.2 材料与方法 | 第94-101页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第94-95页 |
| 4.2.2 主要实验仪器 | 第95-96页 |
| 4.2.3 主要工具酶与试剂 | 第96页 |
| 4.2.4 培养基 | 第96-97页 |
| 4.2.5 定向整合载体的构建 | 第97-99页 |
| 4.2.5.1 里氏木霉基因组DNA的提取 | 第97页 |
| 4.2.5.2 PCR操作方法 | 第97页 |
| 4.2.5.3 左右同源臂的克隆 | 第97-98页 |
| 4.2.5.4 重组质粒pUC-LER的构建 | 第98-99页 |
| 4.2.5.5 重组质粒pUC-H-LER的构建 | 第99页 |
| 4.2.6 原生质体介导将外源基因定向整合到里氏木霉基因组中 | 第99-100页 |
| 4.2.7 重组里氏木霉转化子的筛选与鉴定 | 第100页 |
| 4.2.8 重组里氏木霉定向整合转化子的摇瓶产酶实验 | 第100页 |
| 4.2.9 测定方法 | 第100-101页 |
| 4.2.9.1 纤维二糖水解酶活力的测定 | 第100页 |
| 4.2.9.2 脂肪酶活力测定 | 第100-101页 |
| 4.2.9.3 转化子菌落直径的测定 | 第101页 |
| 4.2.9.4 蛋白质电泳(SDS-PAGE) | 第101页 |
| 4.2.9.5 发酵液中可溶性蛋白的测定 | 第101页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第101-110页 |
| 4.3.1 里氏木霉基因组DNA的提取 | 第101-102页 |
| 4.3.2 重组质粒pMD-L和pMD-R的构建 | 第102-103页 |
| 4.3.3 重组质粒pCB-H-LER的构建 | 第103-104页 |
| 4.3.4 里氏木霉转化子的筛选 | 第104-105页 |
| 4.3.5 里氏木霉转化子的验证 | 第105-106页 |
| 4.3.6 脂肪酶基因在重组里氏木霉中的表达 | 第106页 |
| 4.3.7 里氏木霉定向整合转化子产酶条件优化 | 第106-108页 |
| 4.3.8 里氏木霉定向整合转化子的发酵周期 | 第108-109页 |
| 4.3.9 里氏木霉转化子发酵液的SDS-PAGE分析 | 第109-110页 |
| 4.4 小结 | 第110-112页 |
| 第五章 重组脂肪酶的酶学性质研究 | 第112-125页 |
| 5.1 引言 | 第112页 |
| 5.2 材料与方法 | 第112-116页 |
| 5.2.1 菌株 | 第112页 |
| 5.2.2 主要工具酶与试剂 | 第112页 |
| 5.2.3 培养基 | 第112-113页 |
| 5.2.3.1 毕赤酵母培养基 | 第113页 |
| 5.2.3.2 里氏木霉培养基 | 第113页 |
| 5.2.4 主要实验仪器 | 第113-114页 |
| 5.2.5 发酵产酶实验 | 第114-115页 |
| 5.2.5.1 重组毕赤酵母产酶 | 第114-115页 |
| 5.2.5.2 重组里氏木霉产酶 | 第115页 |
| 5.2.6 测定方法 | 第115-116页 |
| 5.2.6.1 脂肪酶活力的测定 | 第115页 |
| 5.2.6.2 毕赤酵母细胞浓度的测定 | 第115页 |
| 5.2.6.3 最适pH及pH稳定性测定 | 第115页 |
| 5.2.6.4 最适温度及温度稳定性测定 | 第115-116页 |
| 5.2.6.5 脂肪酶水解橄榄油动力学研究 | 第116页 |
| 5.2.6.6 金属离子对脂肪酶活力的影响 | 第116页 |
| 5.2.6.7 有机溶剂对脂肪酶活力的影响 | 第116页 |
| 5.2.6.8 表面活性剂对脂肪酶活力的影响 | 第116页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第116-124页 |
| 5.3.1 重组毕赤酵母产脂肪酶的最适pH及pH稳定性 | 第116-117页 |
| 5.3.2 重组毕赤酵母产脂肪酶的最适温度及温度耐受性 | 第117-118页 |
| 5.3.3 重组里氏木霉产脂肪酶的最适pH及pH稳定性 | 第118-119页 |
| 5.3.4 重组里氏木霉产脂肪酶的最适温度及温度耐受性 | 第119-120页 |
| 5.3.5 不同来源重组脂肪酶的对pH和温度耐受性的比较 | 第120页 |
| 5.3.6 脂肪酶水解橄榄油动力学研究 | 第120-121页 |
| 5.3.7 金属离子对脂肪酶活力的影响 | 第121-122页 |
| 5.3.8 有机溶剂对脂肪酶活力的影响 | 第122-123页 |
| 5.3.9 表面活性剂对脂肪酶活力的影响 | 第123-124页 |
| 5.4 小结 | 第124-125页 |
| 第六章 结论与展望 | 第125-129页 |
| 6.1 结论 | 第125-127页 |
| 6.2 展望 | 第127-128页 |
| 6.3 论文创新点 | 第128-129页 |
| 参考文献 | 第129-143页 |
| 作者简历 | 第143页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第143页 |
