| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第11-22页 |
| 1.1 环糊精 | 第11-12页 |
| 1.2 环糊精葡萄糖基转移酶 | 第12-18页 |
| 1.2.1 CGTase的概述 | 第12-13页 |
| 1.2.2 CGTase的三维结构 | 第13-14页 |
| 1.2.3 CGTase的主要微生物来源 | 第14页 |
| 1.2.4 CGTase的酶学特性 | 第14-15页 |
| 1.2.5 CGTase的异源表达 | 第15-16页 |
| 1.2.6 提高重组CGTase的可溶性表达 | 第16-17页 |
| 1.2.7 CGTase在基因工程菌中的诱导方式 | 第17-18页 |
| 1.3 CGTase研究背景 | 第18-19页 |
| 1.4 论文选题依据及研究意义 | 第19-20页 |
| 1.5 论文主要研究内容与创新点 | 第20-22页 |
| 1.5.1 论文主要研究内容 | 第20页 |
| 1.5.2 论文主要创新点与特色 | 第20-22页 |
| 第二章 嗜热芽孢杆菌CHB1菌株CGTase基因的克隆表达及酶学性质研究 | 第22-44页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 材料 | 第22-25页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第22-23页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.2.1 主要试剂 | 第23页 |
| 2.2.2.2 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.3 培养基 | 第24页 |
| 2.2.4 常用缓冲液及试剂配制 | 第24-25页 |
| 2.3 方法 | 第25-32页 |
| 2.3.1 嗜热芽孢杆菌CHB1菌株基因组DNA的提取 | 第25-26页 |
| 2.3.2 质粒DNA的提取 | 第26页 |
| 2.3.3 质粒DNA的限制性酶切 | 第26页 |
| 2.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第26-27页 |
| 2.3.5 胶回收目的DNA片段 | 第27页 |
| 2.3.6 目的基因与载体的连接 | 第27页 |
| 2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第27页 |
| 2.3.8 CHB1菌株CGTase基因的克隆 | 第27-28页 |
| 2.3.9 表达质粒的构建与验证 | 第28页 |
| 2.3.10 重组菌的诱导表达 | 第28页 |
| 2.3.11 重组CGTase的胞内外表达分析 | 第28-29页 |
| 2.3.12 重组CGTase活性与含量的测定 | 第29-31页 |
| 2.3.12.1 重组CGTase活性测定 | 第29-30页 |
| 2.3.12.2 重组CGTase蛋白质含量测定 | 第30-31页 |
| 2.3.13 重组CGTase的镍柱亲和纯化 | 第31页 |
| 2.3.14 重组CGTase的基本酶学特性 | 第31-32页 |
| 2.3.14.1 温度对重组CGTase α-环化活性的影响 | 第31页 |
| 2.3.14.2 温度对重组CGTase热稳定性的影响 | 第31页 |
| 2.3.14.3 pH对重组CGTase α-环化活性的影响 | 第31页 |
| 2.3.14.4 金属离子及抑制剂对重组CGTase α-环化活性的影响 | 第31页 |
| 2.3.14.5 酶促反应动力学参数测定 | 第31-32页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第32-42页 |
| 2.4.1 环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆 | 第32页 |
| 2.4.2 表达载体pet22b(+)-cgt的构建与验证 | 第32-34页 |
| 2.4.3 重组CGTase的诱导表达 | 第34-35页 |
| 2.4.4 重组CGTase的镍柱亲和纯化 | 第35-36页 |
| 2.4.5 重组CGTase的基本酶学特性 | 第36-42页 |
| 2.4.5.1 温度对重组CGTase α-环化活性的影响 | 第36-37页 |
| 2.4.5.2 pH对重组CGTase α-环化活性的影响 | 第37-38页 |
| 2.4.5.3 重组CGTase的热稳定性 | 第38-39页 |
| 2.4.5.4 金属离子及抑制剂对重组CGTase α-环化活性的影响 | 第39-40页 |
| 2.4.5.5 添加Ca~(2+)对重组CGTase热稳定性的影响 | 第40-41页 |
| 2.4.5.6 酶促反应动力学参数测定 | 第41-42页 |
| 2.5 本章小结 | 第42-44页 |
| 第三章 不同信号肽对重组CGTase胞外分泌的影响 | 第44-55页 |
| 3.1 前言 | 第44页 |
| 3.2 材料 | 第44-45页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第44-45页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第45页 |
| 3.2.2.1 主要试剂 | 第45页 |
| 3.2.2.2 主要仪器 | 第45页 |
| 3.2.3 培养基 | 第45页 |
| 3.3 方法 | 第45-48页 |
| 3.3.1 嗜热芽孢杆菌CHB1菌株基因组DNA的提取 | 第45页 |
| 3.3.2 质粒DNA的提取 | 第45页 |
| 3.3.3 质粒DNA的限制性酶切 | 第45-46页 |
| 3.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第46页 |
| 3.3.5 胶回收目的DNA片段 | 第46页 |
| 3.3.6 目的基因与载体的连接 | 第46页 |
| 3.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第46页 |
| 3.3.8 CHB1菌株CGTase基因的克隆 | 第46-47页 |
| 3.3.9 含有不同信号肽的表达质粒的构建 | 第47-48页 |
| 3.3.10 重组CGTase的诱导表达 | 第48页 |
| 3.3.11 重组CGTase胞内外表达分析 | 第48页 |
| 3.3.12 重组CGTase的活性测定 | 第48页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第48-53页 |
| 3.4.1 CHB1菌株CGTase基因的克隆 | 第48-49页 |
| 3.4.2 CGTase基因的T-A克隆与验证 | 第49页 |
| 3.4.3 携带不同信号肽的重组CGTase表达载体的构建与验证 | 第49-51页 |
| 3.4.4 重组CGTase的诱导表达 | 第51-52页 |
| 3.4.5 不同信号肽的重组CGTase胞外分泌的影响 | 第52-53页 |
| 3.5 本章小结 | 第53-55页 |
| 第四章 重组CGTase发酵条件的优化 | 第55-81页 |
| 4.1 前言 | 第55页 |
| 4.2 材料 | 第55-57页 |
| 4.2.1 菌株 | 第55-56页 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 | 第56-57页 |
| 4.2.2.1 主要试剂 | 第56-57页 |
| 4.2.2.2 主要仪器 | 第57页 |
| 4.2.3 培养基 | 第57页 |
| 4.2.4 常用贮存液配制 | 第57页 |
| 4.3 方法 | 第57-60页 |
| 4.3.1 菌株活化 | 第58页 |
| 4.3.2 种子培养 | 第58页 |
| 4.3.3 菌株摇瓶发酵 | 第58页 |
| 4.3.3.1 IPTG诱导重组CGTase表达 | 第58页 |
| 4.3.3.2 乳糖诱导重组CGTase表达 | 第58页 |
| 4.3.4 重组CGTase胞内外表达分析 | 第58页 |
| 4.3.5 乳糖诱导重组CGTase胞外表达条件 | 第58-59页 |
| 4.3.6 重组CGTase发酵培养基组分优化 | 第59页 |
| 4.3.7 重组CGTase产酶培养条件的优化 | 第59页 |
| 4.3.7.1 初始pH对发酵产酶的影响 | 第59页 |
| 4.3.7.2 装液量对发酵产酶的影响 | 第59页 |
| 4.3.7.3 不同接种量对发酵产酶的影响 | 第59页 |
| 4.3.8 两阶段温度诱导对发酵产酶的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.9 添加化学通透剂对大肠杆菌胞外产CGTase的影响 | 第60页 |
| 4.3.10 化学通透剂的添加时间对胞外分泌的影响 | 第60页 |
| 4.3.11 重组CGTase活性和含量的测定 | 第60页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第60-79页 |
| 4.4.1 不同诱导剂诱导重组CGTase表达 | 第60-61页 |
| 4.4.2 不同诱导剂对胞外酶活的影响 | 第61-62页 |
| 4.4.3 乳糖浓度对菌体生长和产酶的影响 | 第62-63页 |
| 4.4.4 诱导温度对菌体生长和产酶的影响 | 第63-65页 |
| 4.4.5 菌体不同生长期添加乳糖对酶活的影响 | 第65-66页 |
| 4.4.6 乳糖添加方式对目的蛋白表达量的影响 | 第66-67页 |
| 4.4.7 重组CGTase发酵培养基组分优化 | 第67-69页 |
| 4.4.8 重组CGTase产酶培养条件的优化 | 第69-71页 |
| 4.4.8.1 接种量对产酶情况的影响 | 第69-70页 |
| 4.4.8.2 装液量对产酶情况的影响 | 第70-71页 |
| 4.4.8.3 初始pH对产酶情况的影响 | 第71页 |
| 4.4.9 两阶段温度诱导对发酵产酶的影响 | 第71-73页 |
| 4.4.10 初步优化后的乳糖诱导效果分析 | 第73-75页 |
| 4.4.11 添加不同通透剂对胞外分泌的影响 | 第75-76页 |
| 4.4.12 通透剂的添加时间对胞外分泌的影响 | 第76-77页 |
| 4.4.13 甘氨酸和Triton X-100协同作用对胞外分泌的影响 | 第77-79页 |
| 4.5 本章小结 | 第79-81页 |
| 结论 | 第81-83页 |
| 展望 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 个人简历 | 第93页 |
