| 摘要 | 第7-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 符号说明 | 第16-18页 |
| 主要仪器设备 | 第18-19页 |
| 主要数据库及网址 | 第19-20页 |
| 第一章 综述 | 第20-27页 |
| 1 仔猪腹泻与E.coli F18致病机理 | 第20-21页 |
| 2 E.coli F18抗性相关的分子研究 | 第21-22页 |
| 3 microRNA及其调控作用 | 第22-24页 |
| 4 基因修饰技术 | 第24-25页 |
| 5 本研究的目的和意义 | 第25-27页 |
| 第二章 miRNA192及其靶基因对苏太断奶仔猪大肠杆菌抗性的作用分析 | 第27-70页 |
| 第一节 基于定量PCR技术检测大肠杆菌黏附水平方法的建立 | 第27-34页 |
| 1 材料方法 | 第27-29页 |
| 1.1 材料 | 第27-28页 |
| 1.2 引物设计及PCR扩增 | 第28页 |
| 1.3 实时荧光定量标准曲线的制定 | 第28页 |
| 1.4 大肠杆菌黏附肠上皮细胞及DNA提取 | 第28-29页 |
| 1.5 数据分析 | 第29页 |
| 2 结果与分析 | 第29-32页 |
| 2.1 PCR扩增产物鉴定 | 第29-30页 |
| 2.2 标准曲线 | 第30页 |
| 2.3 定量检测细菌相对黏附及数据分析 | 第30-32页 |
| 3 讨论 | 第32-34页 |
| 第二节 miRNA192靶基因预测及其关键靶基因的靶向验证 | 第34-45页 |
| 1 材料与方法 | 第34-36页 |
| 1.1 试验材料 | 第34页 |
| 1.2 miR-192在不同物种中的保守性分析 | 第34页 |
| 1.3 miR-192靶基因预测及功能分析 | 第34-35页 |
| 1.4 E.coli F18大肠杆菌抗性相关的靶基因筛选及功能分析 | 第35页 |
| 1.5 靶基因3'-UTR靶点区域的oligos序列合成 | 第35页 |
| 1.6 双荧光素酶报告载体的构建 | 第35-36页 |
| 1.7 细胞转染 | 第36页 |
| 1.8 双荧光素酶活性检测 | 第36页 |
| 2 结果与分析 | 第36-42页 |
| 2.1 miR-192保守性 | 第36-37页 |
| 2.2 猪miR-192靶基因预测及功能 | 第37-40页 |
| 2.3 E.coli F18大肠杆菌感染相关的靶基因筛选 | 第40页 |
| 2.4 ALCAM和DLG5基因3'-UTR双荧光素酶报告载体 | 第40-41页 |
| 2.5 荧光素酶报告基因活性检测 | 第41-42页 |
| 3 讨论 | 第42-45页 |
| 第三节 关键靶基因(DLG5、ALCAM)的差异表达分析 | 第45-52页 |
| 1 材料与方法 | 第45-47页 |
| 1.1 试验动物 | 第45-46页 |
| 1.2 试剂 | 第46页 |
| 1.3 荧光定量引物设计与合成 | 第46页 |
| 1.4 总RNA抽提及Real-time PCR反应 | 第46页 |
| 1.5 数据分析 | 第46-47页 |
| 2 结果 | 第47-49页 |
| 2.1 荧光定量引物PCR验证情况 | 第47页 |
| 2.2 DLG5和ALCAM基因在苏太猪大肠杆菌抗性敏感群体间的表达 | 第47-48页 |
| 2.3 DLG5和ALCAM基因在苏太猪不同日龄个体中的表达 | 第48-49页 |
| 3 讨论 | 第49-52页 |
| 第四节 大肠杆菌侵染对miR-192及其关键靶基因转录水平的影响 | 第52-56页 |
| 1 材料与方法 | 第52-53页 |
| 1.1 试验材料 | 第52页 |
| 1.2 大肠杆菌及培养上清液侵染IPEC-J2细胞 | 第52-53页 |
| 1.3 miR-192反转录和定量检测 | 第53页 |
| 1.4 靶基因转录水平的检测 | 第53页 |
| 2 结果与分析 | 第53-54页 |
| 2.1 大肠杆菌侵染对IPEC-J2细胞中miR-192的影响 | 第53-54页 |
| 2.2 关键靶基因表达 | 第54页 |
| 3 讨论 | 第54-56页 |
| 第五节 miRNA192敲除及其功能验证 | 第56-70页 |
| 1 材料和方法 | 第56-60页 |
| 1.1 材料 | 第56页 |
| 1.2 TALEN识别序列设计 | 第56-57页 |
| 1.3 TALEN左右臂载体组装连接及鉴定 | 第57-58页 |
| 1.4 嘌呤霉素最小致死浓度 | 第58页 |
| 1.5 TALEN左右臂质粒载体共转染IPEC-J2细胞 | 第58页 |
| 1.6 嘌呤霉素筛选及鉴定 | 第58页 |
| 1.7 单克隆细胞株挑选及鉴定 | 第58页 |
| 1.8 阳性单克隆细胞miR-192的表达鉴定 | 第58-59页 |
| 1.9 miR-192宿主基因及靶基因转录水平检测 | 第59-60页 |
| 1.10 大肠杆菌黏附水平验证 | 第60页 |
| 2 结果与分析 | 第60-68页 |
| 2.1 酶切鉴定结果 | 第60页 |
| 2.2 测序比对结果 | 第60-63页 |
| 2.3 转染IPEC-J2细胞及靶点区域片段扩增及测序 | 第63-64页 |
| 2.4 单克隆细胞株miR-192打靶情况的鉴定及分析 | 第64-66页 |
| 2.5 miR-192表达水平的检测 | 第66-67页 |
| 2.6 miR-192宿主基因扩增和转录水平 | 第67页 |
| 2.7 miR-192靶基因在敲除细胞中表达水平 | 第67-68页 |
| 2.8 miR-192敲除对IPEC-J2细胞黏附大肠杆菌能力的影响 | 第68页 |
| 3 讨论 | 第68-70页 |
| 第三章 梅山断奶仔猪大肠杆菌抗性相关microRNAs筛选及其功能分析 | 第70-109页 |
| 第一节 miRNA192在梅山猪中表达分析 | 第70-73页 |
| 1 材料与方法 | 第70-71页 |
| 1.1 材料 | 第70页 |
| 1.2 miR-192探针合成 | 第70页 |
| 1.3 总RNA抽提及反转录 | 第70-71页 |
| 1.4 组织表达谱分析 | 第71页 |
| 2 结果与分析 | 第71-72页 |
| 2.1 miR-192的组织表达谱检测 | 第71-72页 |
| 2.2 攻毒组与对照组个体十二指肠和空肠中miR-192的表达 | 第72页 |
| 3 讨论 | 第72-73页 |
| 第二节 梅山猪断奶仔猪大肠杆菌抗性型和敏感型全同胞个体差异microRNAs的筛选 | 第73-87页 |
| 1 材料与方法 | 第73-76页 |
| 1.1 实验动物及样本采集 | 第73页 |
| 1.2 试剂材料 | 第73页 |
| 1.3 小RNA文库建立及高通量测序 | 第73-74页 |
| 1.4 测序数据的质量控制和预处理分析 | 第74页 |
| 1.5 序列比对及分类注释 | 第74页 |
| 1.6 比对统计 | 第74-75页 |
| 1.7 碱基偏好性统计分析 | 第75页 |
| 1.8 Novel miRNAs预测 | 第75页 |
| 1.9 miRNA差异表达分析 | 第75页 |
| 1.10 差异miRNA功能分析 | 第75页 |
| 1.11 靶基因GO功能分析 | 第75-76页 |
| 1.12 靶基因KEGG pathway分析 | 第76页 |
| 1.13 差异miRNAs的QPCR验证 | 第76页 |
| 2 结果与分析 | 第76-85页 |
| 2.1 总RNA质量检测 | 第76-77页 |
| 2.2 染色体分布 | 第77-78页 |
| 2.3 small RNA序列分类统计 | 第78-79页 |
| 2.4 碱基偏好性统计 | 第79-80页 |
| 2.5 小RNA在抗性敏感型个体中分布 | 第80页 |
| 2.6 差异miRNA筛选 | 第80-82页 |
| 2.7 差异miRNA靶基因功能富集分析 | 第82-84页 |
| 2.8 差异miRNAs定量PCR验证 | 第84页 |
| 2.9 关键靶基因分析和确定 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-87页 |
| 第三节 大肠杆菌侵染对细胞中TLR4通路相关基因的影响 | 第87-92页 |
| 1 材料方法 | 第87-88页 |
| 2 结果与分析 | 第88-90页 |
| 3 讨论 | 第90-92页 |
| 第四节 MyD88基因沉默及其对所在TLR4通路基因表达水平的影响 | 第92-102页 |
| 1 材料与方法 | 第92-95页 |
| 1.1 材料 | 第92页 |
| 1.2 引物设计及序列合成 | 第92-93页 |
| 1.3 干扰载体构建 | 第93页 |
| 1.4 表达载体构建 | 第93-94页 |
| 1.5 细胞转染及干扰效率验证 | 第94页 |
| 1.6 慢病毒载体包装及滴度测定 | 第94-95页 |
| 1.7 病毒液感染猪IPEC-J2和PK15细胞 | 第95页 |
| 1.8 定量检测MyD88基因沉默PK15细胞中TLR4通路相关基因表达 | 第95页 |
| 1.9 细胞培养上清炎性因子检测 | 第95页 |
| 2 结果分析 | 第95-100页 |
| 2.1 载体构建 | 第95-96页 |
| 2.2 干扰效率验证 | 第96-97页 |
| 2.3 慢病毒液滴度测定 | 第97页 |
| 2.4 干扰病毒颗粒对IPEC-J2和PK15细胞MyD88的干扰效率 | 第97-99页 |
| 2.5 MyD88基因沉默对TLR4通路相关基因表达的影响 | 第99页 |
| 2.6 MyD88基因沉默对细胞培养液中免疫因子水平影响 | 第99-100页 |
| 3 讨论 | 第100-102页 |
| 第五节 大肠杆菌侵袭对MyD88基因沉默PK15细胞的效应分析 | 第102-109页 |
| 1 材料与方法 | 第102页 |
| 2 结果与分析 | 第102-107页 |
| 3 讨论 | 第107-109页 |
| 全文结论 | 第109-110页 |
| 创新之处 | 第110-111页 |
| 参考文献 | 第111-121页 |
| 致谢 | 第121-123页 |
| 攻读学位期间发表学术论文 | 第123-124页 |
