| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第10-22页 |
| 1.1 CRISPR/Cas系统发现历史 | 第10页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统结构特点 | 第10-12页 |
| 1.2.1 CRISPR重复序列 | 第10-11页 |
| 1.2.2 间隔序列 | 第11页 |
| 1.2.3 前导序列 | 第11页 |
| 1.2.4 Cas蛋白 | 第11-12页 |
| 1.3 CRISPR/Cas系统的分类 | 第12-13页 |
| 1.3.1 Type Ⅰ | 第12页 |
| 1.3.2 Type Ⅱ | 第12-13页 |
| 1.3.3 Type Ⅲ | 第13页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9系统的作用机制 | 第13-15页 |
| 1.4.1 新Spacer的获得 | 第13-15页 |
| 1.4.2 CRISPR的转录与加工 | 第15页 |
| 1.4.3 CRISPR系统沉默入侵DNA | 第15页 |
| 1.5 区分敌我机制 | 第15-16页 |
| 1.6 噬菌体与细菌的共进化 | 第16-17页 |
| 1.6.1 噬菌体促进细菌CRISPR序列多态变化 | 第16页 |
| 1.6.2 噬菌体在CRISPR抗性压力下突变 | 第16-17页 |
| 1.7 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第17-18页 |
| 1.8 CRISPR/Cas系统与TALEN、ZFNs的比较 | 第18页 |
| 1.9 Xa5基因抗白叶枯病的机理 | 第18-19页 |
| 1.10 香味基因Badh2致使水稻变香机理 | 第19-20页 |
| 1.11 技术路线 | 第20-21页 |
| 1.12 研究目的及意义 | 第21-22页 |
| 2 实验材料与方法 | 第22-39页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第22页 |
| 2.1.2 菌株与载体质粒 | 第22页 |
| 2.1.3 主要试剂和酶 | 第22页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第22页 |
| 2.1.5 引物 | 第22-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-39页 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas9系统的设计 | 第23-24页 |
| 2.2.2 目的片因pOsU3gRNA和2NLSCas9的克隆 | 第24-26页 |
| 2.2.3 克隆载体PMD18T-pOsU3gRNA的构建及鉴定 | 第26-28页 |
| 2.2.4 植物表达载体的构建及鉴定 | 第28-30页 |
| 2.2.5 靶序列-pOsU3gRNA-2NLSCas9重组质粒构建最优退火温度筛选及鉴定 | 第30-32页 |
| 2.2.6 靶序列-pOsU3gRNA-2NLSCas9重组质粒构建最优连接摩尔比筛选及鉴定 | 第32-33页 |
| 2.2.7 农杆菌的转化及鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.8 水稻转基因植株的获得 | 第34-35页 |
| 2.2.9 水稻转基因植株的DNA分子检测 | 第35-36页 |
| 2.2.10 由CRISPR/Cas9系统引起水稻转基因植株的靶位点突变检测 | 第36-38页 |
| 2.2.11 T1代水稻转基因植株的抗病性分析 | 第38页 |
| 2.2.12 T1代水稻转基因植株的农艺性状调查 | 第38-39页 |
| 3. 结果与分析 | 第39-58页 |
| 3.1 Xa5-1-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、Xa5-2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、Badh2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301表达载体质粒的构建及鉴定 | 第39-46页 |
| 3.1.1 目的基因pOsU3gRNA的克隆 | 第39页 |
| 3.1.2 pOsU3gRNA-1301重组质粒的构建和检测 | 第39-40页 |
| 3.1.3 pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301重组质粒的构建及检测 | 第40-41页 |
| 3.1.4 靶序列-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301重组质粒构建检测及分析 | 第41-46页 |
| 3.2 Xa5-1-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、Xa5-2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301、Badh2-pOsU3gRNA-2NLSCas9-1301这3个重组质粒农杆菌转化的检测 | 第46-47页 |
| 3.3 T_o代水稻转基因植株的获得 | 第47页 |
| 3.4 T_0代水稻转基因植株的DNA PCR鉴定 | 第47-49页 |
| 3.5 T_0代水稻转基因植株的靶位点突变鉴定 | 第49-53页 |
| 3.5.1 愈伤分化阶段靶序列的突变鉴定 | 第49-50页 |
| 3.5.2 T_0代转基因植株分蘖期靶序列的突变鉴定 | 第50-53页 |
| 3.6 T_1代水稻转基因植株的靶位点突变鉴定 | 第53-55页 |
| 3.7 T_1代水稻转基因植株的DNA PCR鉴定 | 第55-56页 |
| 3.8 T_1代水稻转基因植株抗病性鉴定 | 第56页 |
| 3.9 T_1代水稻转基因植农艺性状分析 | 第56-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9系统植物表达载体构建体系 | 第58页 |
| 4.2 靶位点Xa5及Badh2突变分析 | 第58-59页 |
| 4.3 CRISPR/Cas9系统的应用前景 | 第59页 |
| 4.4 Xa5的抗病分析 | 第59-60页 |
| 5 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-65页 |
| 附录 | 第65-68页 |
| 附录一：实验相关试剂的配制方法 | 第65-67页 |
| 附录二：缩写对照表(Abbreviations) | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
