| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 符号说明 | 第12-13页 |
| 文献综述 | 第13-26页 |
| 1 支气管波氏杆菌的研究概况 | 第13-19页 |
| ·形态和培养特性 | 第13-14页 |
| ·抗原 | 第14-15页 |
| ·毒素 | 第15-17页 |
| ·腺苷环化酶溶血素 | 第16页 |
| ·皮肤坏死毒素或不耐热毒素 | 第16-17页 |
| ·气管细胞毒素 | 第17页 |
| ·其它生物学特性 | 第17-19页 |
| ·丝状血凝素 | 第17页 |
| ·百日咳杆菌黏附素 | 第17-18页 |
| ·菌毛 | 第18页 |
| ·Ⅲ型分泌系统(type-Ⅲ secretion system) | 第18-19页 |
| 2 支气管波氏杆菌病的研究现状 | 第19-21页 |
| ·支气管败血波氏杆菌病的流行性病学 | 第19-20页 |
| ·支气管败血波氏杆菌病的临床症状及病理变化 | 第20页 |
| ·支气管败血波氏杆菌病的防治措施 | 第20-21页 |
| 3 支气管败血波氏杆菌病诊断方法的研究 | 第21-23页 |
| ·普通细菌学检测方法 | 第21页 |
| ·血清学诊断方法 | 第21-22页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR)检测方法 | 第22-23页 |
| ·16SrRNA测序 | 第23页 |
| 4 支气管波氏杆菌菌毛蛋白研究进展 | 第23-26页 |
| 第一章 兔支气管败血波氏杆菌FIMN基因的克隆 | 第26-35页 |
| 1 材料 | 第26-27页 |
| ·菌种和质料 | 第26-27页 |
| ·主要试剂 | 第27页 |
| 2 方法 | 第27-31页 |
| ·fimN基因的扩增与克隆 | 第27-28页 |
| ·Bb基因组DNA的提取 | 第27页 |
| ·fimN引物设计和合成 | 第27页 |
| ·PCR反应扩增体系 | 第27-28页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第28页 |
| ·目的基因的克隆 | 第28-30页 |
| ·产物与T载体连接 | 第29页 |
| ·感受态细胞制备 | 第29页 |
| ·转化 | 第29-30页 |
| ·重组质粒的提取与鉴定 | 第30-31页 |
| ·小量提取质粒(碱裂解法) | 第30页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第30-31页 |
| 3 结果 | 第31-33页 |
| ·fimN基因的扩增 | 第31-32页 |
| ·fimN在T载体中的克隆及鉴定 | 第32-33页 |
| ·PCR法鉴定 | 第32页 |
| ·重组质粒酶切鉴定 | 第32-33页 |
| ·目的基因的序列分析 | 第33页 |
| 4 讨论 | 第33-35页 |
| 第二章 FIMN基因的表达及免疫原性分析 | 第35-46页 |
| 1 材判 | 第35-36页 |
| ·质粒和菌种 | 第35页 |
| ·主要试剂 | 第35-36页 |
| 2 方法 | 第36-40页 |
| ·fimN基因原核表达载体的构建 | 第36-37页 |
| ·重组质粒DNA的双酶切处理及产物的回收 | 第36-37页 |
| ·连接反应 | 第37页 |
| ·连接产物转化 | 第37页 |
| ·重组质粒的提取及鉴定 | 第37页 |
| ·fimN基因的诱导表达及条件优化 | 第37-39页 |
| ·重组质粒pET28a-fimN转化 | 第37-38页 |
| ·重组质粒在大肠杆菌中的表达 | 第38页 |
| ·IPTG诱导培养时间的优化 | 第38-39页 |
| ·表达蛋白的纯化 | 第39页 |
| ·包涵体的获取与裂解 | 第39页 |
| ·重组表达蛋白的纯化 | 第39页 |
| ·重组表达蛋白的免疫原性分析 | 第39-40页 |
| 3 结果 | 第40-44页 |
| ·fimN的原核表达载体的构建 | 第40-41页 |
| ·fimN基因的表达及条件优化 | 第41-43页 |
| ·fimN基因的表达 | 第41-42页 |
| ·表达时间优化 | 第42-43页 |
| ·重组表达蛋白的纯化 | 第43页 |
| ·重组表达蛋白的免疫原性分析 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-46页 |
| 第三章 支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立 | 第46-56页 |
| 1 材料 | 第46-47页 |
| ·菌种 | 第46-47页 |
| ·主要试剂 | 第47页 |
| 2 方法 | 第47-50页 |
| ·引物设计与合成 | 第47页 |
| ·模板DNA的制备 | 第47页 |
| ·PCR反应体系 | 第47-48页 |
| ·PCR反应条件优化 | 第48-49页 |
| ·最佳退火温度 | 第48页 |
| ·MgCl_2浓度梯度 | 第48-49页 |
| ·引物最佳浓度 | 第49页 |
| ·PCR敏感性试验 | 第49页 |
| ·PCR特异性试验 | 第49页 |
| ·PCR扩增产物的克隆及目的片段的序列分析 | 第49-50页 |
| ·分离株的检测 | 第50页 |
| 3 结果 | 第50-53页 |
| ·PCR扩增 | 第50页 |
| ·PCR反应条件优化 | 第50-51页 |
| ·PCR敏感性试验 | 第51-52页 |
| ·PCR特异性试验 | 第52页 |
| ·PCR扩增产物的克隆及目的片段的序列分析 | 第52-53页 |
| ·PCR法检测分离株 | 第53页 |
| 4 讨论 | 第53-56页 |
| 第四章 支气管败血波氏杆菌间接ELISA诊断方法建立 | 第56-67页 |
| 1 材料 | 第56-57页 |
| ·抗原 | 第56页 |
| ·血清 | 第56页 |
| ·主要试剂 | 第56-57页 |
| 2 方法 | 第57-60页 |
| ·阳性血清的制备 | 第57页 |
| ·ELISA最佳反应条件的选择 | 第57-59页 |
| ·抗原包被最佳浓度和阳性血清最适浓度的选择 | 第57-58页 |
| ·最佳封闭液的确定 | 第58页 |
| ·封闭时间的确定 | 第58页 |
| ·阴阳性血清最佳反应时间的确定 | 第58页 |
| ·酶标抗体作用时间的选择 | 第58-59页 |
| ·ELISA结果判定 | 第59页 |
| ·敏感性试验 | 第59页 |
| ·交叉反应试验 | 第59页 |
| ·阻断试验 | 第59-60页 |
| ·重复性试验 | 第60页 |
| ·ELISA方法的应用 | 第60页 |
| 3 结果 | 第60-66页 |
| ·抗原包被最佳浓度和阳性血清最适浓度的选择 | 第60-61页 |
| ·最佳封闭液的确定 | 第61页 |
| ·最佳封闭时间 | 第61-62页 |
| ·阴阳性血清最佳反应时间的确定 | 第62页 |
| ·酶标抗体最佳作用时间的选择 | 第62-63页 |
| ·ELISA结果判定 | 第63页 |
| ·敏感性试验 | 第63-64页 |
| ·交叉反应试验 | 第64页 |
| ·阻断试验 | 第64-65页 |
| ·重复性试验 | 第65-66页 |
| ·ELISA方法的应用 | 第66页 |
| 4 讨论 | 第66-67页 |
| 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-75页 |
| 附录 常用缓冲液及溶液配制 | 第75-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第80-81页 |