| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第9-19页 |
| 1.1 生物催化 | 第9页 |
| 1.2 手性化合物及中间体 | 第9-13页 |
| 1.2.1 手性化合物 | 第9-10页 |
| 1.2.2 手性化合物的拆分 | 第10-12页 |
| 1.2.3 手性化合物的合成 | 第12-13页 |
| 1.2.4 药物中间体的研究进展 | 第13页 |
| 1.3 抗胆碱药物 | 第13-14页 |
| 1.4 羰基还原酶 | 第14-16页 |
| 1.4.1 羰基还原酶的分类和催化反应 | 第14页 |
| 1.4.2 羰基还原酶的催化及研究进展 | 第14-16页 |
| 1.4.3 奎宁酮还原酶的催化机理 | 第16页 |
| 1.5 手性奎宁醇 | 第16-17页 |
| 1.5.1 手性奎宁醇的合成 | 第16-17页 |
| 1.5.2 手性奎宁醇的用途 | 第17页 |
| 1.6 本课题的研究意义 | 第17-19页 |
| 1.6.1 本课题的研究意义 | 第17页 |
| 1.6.2 本课题的研究内容 | 第17-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-34页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第19-24页 |
| 2.1.1 质粒、菌株及培养基 | 第19页 |
| 2.1.2 主要试剂及分子生物学试剂盒 | 第19-21页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第21-22页 |
| 2.1.4 溶液配制 | 第22-24页 |
| 2.2 奎宁酮还原酶的获取及不对称还原合成奎宁醇 | 第24-30页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第24-29页 |
| 2.2.2 重组载体构建 | 第29页 |
| 2.2.3 基因工程菌构建 | 第29-30页 |
| 2.2.4 目的基因的表达 | 第30页 |
| 2.2.5 酶催化奎宁酮反应 | 第30页 |
| 2.3 产物奎宁醇的分离纯化及鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.1 产物分析 | 第30页 |
| 2.3.2 产物分离纯化 | 第30-31页 |
| 2.3.3 产物核磁鉴定 | 第31页 |
| 2.3.4 衍生反应 | 第31页 |
| 2.3.5 产物构型检测 | 第31页 |
| 2.4 奎宁酮还原酶纯化条件摸索 | 第31-32页 |
| 2.4.1 ReQR-13蛋白纯化 | 第31-32页 |
| 2.4.2 ReQR-18蛋白纯化 | 第32页 |
| 2.5 目的蛋白酶活检测 | 第32-33页 |
| 2.5.1 酶标仪检测酶活 | 第32-33页 |
| 2.5.2 还原反应检测酶活 | 第33页 |
| 2.6 底物与产物标准曲线的制作 | 第33页 |
| 2.6.1 底物标准曲线的制作 | 第33页 |
| 2.6.2 产物标准曲线的制作 | 第33页 |
| 2.7 全细胞催化还原反应 | 第33-34页 |
| 2.7.1 全细胞催化反应建立 | 第33页 |
| 2.7.2 催化产物检测 | 第33-34页 |
| 3 结果与讨论 | 第34-47页 |
| 3.1 奎宁酮还原酶基因获取及不对称还原合成奎宁醇 | 第34-37页 |
| 3.1.1 奎宁酮还原酶基因克隆 | 第34页 |
| 3.1.2 奎宁酮还原酶序列比对及分析 | 第34-35页 |
| 3.1.3 目的基因表达 | 第35-36页 |
| 3.1.4 酶催化奎宁酮反应 | 第36-37页 |
| 3.2 产物奎宁醇的分离纯化及鉴定 | 第37页 |
| 3.2.1 产物分离纯化 | 第37页 |
| 3.2.2 产物核磁鉴定 | 第37页 |
| 3.2.3 产物构型检测 | 第37页 |
| 3.3 目的基因的表达条件优化 | 第37-40页 |
| 3.4 奎宁酮还原酶纯化条件摸索 | 第40-43页 |
| 3.4.1 目的基因的标签选择 | 第40-42页 |
| 3.4.2 目的蛋白的纯化结果 | 第42-43页 |
| 3.5 目的蛋白纯化后活性检测 | 第43-44页 |
| 3.5.1 酶标仪检测酶活 | 第43-44页 |
| 3.5.2 还原反应检测酶活 | 第44页 |
| 3.6 底物和产物标准曲线的制作 | 第44-45页 |
| 3.6.1 底物标准曲线的制作 | 第44-45页 |
| 3.6.2 产物标准曲线的制作 | 第45页 |
| 3.7 全细胞催化还原反应 | 第45-47页 |
| 3.7.1 全细胞催化还原反应进程 | 第45-47页 |
| 4 结论 | 第47-48页 |
| 5 展望 | 第48-49页 |
| 6 参考文献 | 第49-58页 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第58-59页 |
| 8 致谢 | 第59-60页 |
| 附录 | 第60-67页 |