| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-11页 |
| 1. 绪论 | 第11-27页 |
| ·超长链单不饱和脂肪酸 | 第11-14页 |
| ·超长链单不饱和脂肪酸的定义和命名 | 第11-12页 |
| ·超长链单不饱和脂肪酸的物化性质 | 第12页 |
| ·超长链单不饱和脂肪酸的合成途径 | 第12-14页 |
| ·神经酸 | 第14-15页 |
| ·神经酸的分布和功能作用 | 第14-15页 |
| ·神经酸的合成和代谢工程研究进展 | 第15页 |
| ·3-酮脂酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase,KCS)基因 | 第15-18页 |
| ·KCS基因在超长链脂肪酸延长途径的地位 | 第15-16页 |
| ·拟南芥FAE1基因 | 第16-17页 |
| ·酵母ELO基因 | 第17-18页 |
| ·蒜头果 | 第18-19页 |
| ·蒜头果有效成分的研究 | 第18-19页 |
| ·蒜头果基因组DNA的提取 | 第19页 |
| ·耶鲁维亚酵母(Yarrowia lipolytica) | 第19-22页 |
| ·耶鲁维亚酵母基本情况介绍 | 第19-20页 |
| ·耶鲁维亚酵母的应用 | 第20-21页 |
| ·耶鲁维亚酵母的转化体系研究 | 第21-22页 |
| ·DGA1基因 | 第22页 |
| ·高效率TAIL PCR技术 | 第22-23页 |
| ·高效的质粒组装方法Gibson Assembly | 第23-24页 |
| ·高效Gibson Assembly方法的基本原理 | 第23-24页 |
| ·高效Gibson Assembly所需PCR引物设计 | 第24页 |
| ·降落PCR(touch-down PCR) | 第24-25页 |
| ·研究的目的和意义,以及主要研究内容 | 第25-27页 |
| ·研究的目的和意义 | 第25页 |
| ·主要研究内容 | 第25-27页 |
| 2. 海洋微藻(Mychonastes afer HSO-3-1)KCS基因的克隆及耶鲁维亚酵母(Yarrowia lipolytica)载体的构建 | 第27-46页 |
| ·材料与仪器 | 第27-28页 |
| ·材料 | 第27页 |
| ·仪器 | 第27-28页 |
| ·方法 | 第28-38页 |
| ·微藻基因组DNA的提取 | 第28-29页 |
| ·引物的设计 | 第29页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR) | 第29-30页 |
| ·PCR产物的琼脂糖凝胶纯化 | 第30页 |
| ·做T1载体TA连接 | 第30-31页 |
| ·做大肠杆菌(E.coli DH5α)热激法转化 | 第31页 |
| ·菌种的保藏和微藻KCS基因的测序 | 第31-32页 |
| ·限制性内切酶酶切 | 第32页 |
| ·酶切产物的琼脂糖凝胶纯化 | 第32-33页 |
| ·Solution Ⅰ连接 | 第33页 |
| ·连接产物的大肠杆菌(E.coli DH5α)转化 | 第33-34页 |
| ·菌种的保藏和送测序 | 第34页 |
| ·用质粒载体小提试剂盒提取质粒pYLEX1-ZKCS | 第34-35页 |
| ·限制性内切酶酶切pYLEX1-ZKCS质粒 | 第35页 |
| ·耶鲁维亚酵母(Yarrowia lipolyica)Polg菌株的转化 | 第35-36页 |
| ·酵母阳性克隆子的PCR验证 | 第36页 |
| ·耶鲁维亚酵母Polg(pYLEX1-ZKCS)的产油培养 | 第36-38页 |
| ·气相色谱分析脂肪酸成分 | 第38页 |
| ·结果与分析 | 第38-45页 |
| ·微藻基因组DNA的提取 | 第38-39页 |
| ·微藻KCS基因(ZKCS gene)的克隆 | 第39-40页 |
| ·酶切产物连接转化阳性克隆子的选取 | 第40页 |
| ·表达载体pLEXl-ZKCS在耶鲁维亚酵母Polg中表达 | 第40-41页 |
| ·耶鲁维亚酵母Polg(pYLEX1)、Polg(pYLEX1-ZKCS)产油培养 | 第41-42页 |
| ·耶鲁维亚酵母培养基残糖含量的测定 | 第42-43页 |
| ·耶鲁维亚酵母Polg(pYLEX1)、Polg(pYLEX1-ZKCS)总油脂的提取 | 第43-44页 |
| ·气相色谱结果与分析 | 第44-45页 |
| ·本章小结 | 第45-46页 |
| 3. 用高效Gibson Assembly方法构建多基因表达载体 | 第46-62页 |
| ·材料与仪器 | 第46-47页 |
| ·材料 | 第46页 |
| ·仪器 | 第46-47页 |
| ·方法 | 第47-55页 |
| ·根据Gibson Assembly方法要求设计引物 | 第47-52页 |
| ·PCR获得所需DNA片段 | 第52-53页 |
| ·Gibson Assembly和转化 | 第53-54页 |
| ·阳性克隆子的挑选和验证 | 第54-55页 |
| ·耶鲁维亚酵母的转化 | 第55页 |
| ·耶鲁维亚酵母的产油培养 | 第55页 |
| ·酵母的油脂提取和分析 | 第55页 |
| ·结果和分析 | 第55-60页 |
| ·PCR结果 | 第55-56页 |
| ·大肠杆菌DH5α阳性克隆子的筛选 | 第56-58页 |
| ·耶鲁维亚酵母阳性克隆子的筛选 | 第58页 |
| ·耶鲁维亚酵母转化子的生长曲线 | 第58页 |
| ·耶鲁维亚酵母转化子的产油培养结果 | 第58-59页 |
| ·气相色谱分析 | 第59-60页 |
| ·本章小结 | 第60-62页 |
| 4. 蒜头果3-酮脂酰-CoA合酶基因的克隆 | 第62-77页 |
| ·材料与仪器 | 第62-63页 |
| ·材料 | 第62页 |
| ·仪器 | 第62-63页 |
| ·方法 | 第63-70页 |
| ·蒜头果基因组DNA的提取 | 第63页 |
| ·短引物的设计 | 第63-64页 |
| ·短引物PCR | 第64-65页 |
| ·短引物PCR产物的分析和选择 | 第65页 |
| ·琼脂糖凝胶回收短引物PCR片段 | 第65页 |
| ·pEASY-T1的TA连接 | 第65页 |
| ·连接质粒的大肠杆菌E.coli DH5α转化 | 第65-66页 |
| ·colony PCR选取阳性克隆子 | 第66页 |
| ·比对所得序列 | 第66页 |
| ·设计TAIL PCR引物 | 第66-67页 |
| ·高效TAIL PCR | 第67-70页 |
| ·琼脂糖凝胶回收PCR片段 | 第70页 |
| ·pEASY-T1的TA连接 | 第70页 |
| ·连接质粒的大肠杆菌E.coli DH5α转化 | 第70页 |
| ·colony PCR选取阳性克隆子 | 第70页 |
| ·序列的比对分析 | 第70页 |
| ·结果与分析 | 第70-76页 |
| ·利用短引物PCR结果 | 第70-71页 |
| ·pEASY-T1连接和大肠杆菌转化和阳性克隆子的挑选 | 第71-72页 |
| ·对短引物PCR结果分析 | 第72页 |
| ·高效TAIL PCR结果分析 | 第72-73页 |
| ·高效TAIL-PCR所得片段琼脂糖凝胶电泳回收 | 第73-74页 |
| ·RB2000、LB1000和LB750做pEASY-T1的TA连接和转化 | 第74页 |
| ·蒜头果KCS基因的预测和初步分析 | 第74页 |
| ·蒜头果KCS基因的预测和初歩分析 | 第74-76页 |
| ·本章小结 | 第76-77页 |
| 5. 结论 | 第77-79页 |
| 研究结果 | 第77-78页 |
| 创新点 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第83-84页 |
