| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 第一章 减毒沙门氏菌递送鸭瘟DNA疫苗的研究进展 | 第12-24页 |
| 1 减毒沙门氏菌用于DNA疫苗递送 | 第12-14页 |
| ·沙门氏菌与宿主细胞的相互作用 | 第12-13页 |
| ·减毒沙门氏菌作为疫苗载体 | 第13页 |
| ·减毒沙门氏菌用于DNA疫苗递送的优势及研究进展 | 第13-14页 |
| 2 DNA疫苗的研究进展 | 第14-20页 |
| ·DNA疫苗概述 | 第15页 |
| ·增强DNA疫苗效力的方法 | 第15-19页 |
| ·DNA疫苗口服免疫途径的应用 | 第19-20页 |
| 3 鸭瘟概述 | 第20-22页 |
| ·鸭瘟概述 | 第20页 |
| ·鸭瘟病毒免疫原性特征 | 第20-21页 |
| ·鸭瘟病毒DNA疫苗的研究现状 | 第21-22页 |
| 4 选题目的和意义 | 第22-24页 |
| 第二章 新颖通用型DNA疫苗载体的构建及其真核表达能力的研究 | 第24-37页 |
| 1 材料 | 第24-25页 |
| ·主要质粒、菌株、细胞及试剂 | 第24-25页 |
| ·主要的仪器设备 | 第25页 |
| 2 方法 | 第25-29页 |
| ·单元基因引物设计 | 第25-26页 |
| ·单元基因片段扩增 | 第26-27页 |
| ·(1/2DTSⅡ+asd+CpG+pUC),(BGH late poly A+CpG+SV40 enhancer)和(CMVMCS+CpG+SV40late poly A+1/2DTSⅡ)模板片段的构建 | 第27-28页 |
| ·类生物合成新颖通用型DNA疫苗载体pkDNA | 第28页 |
| ·pkDNA载体质粒的酶切及测序鉴定 | 第28页 |
| ·pkDNA-egfp质粒的构建 | 第28-29页 |
| ·荧光显微镜观察pkDNA-egfp质粒在COS-7中的表达 | 第29页 |
| 3 结果 | 第29-34页 |
| ·单片段的PCR扩增结果 | 第29-30页 |
| ·三模板片段的融合PCR结果 | 第30-31页 |
| ·pkDNA质粒的合成及PCR鉴定 | 第31页 |
| ·pkDNA测序结果 | 第31-32页 |
| ·pkDNA-egfp质粒的构建 | 第32-33页 |
| ·荧光显微镜观察pkDNA-egfp质粒在COS-7中的表达结果 | 第33-34页 |
| 4 讨论 | 第34-36页 |
| ·平衡致死质粒宿主系统作为质粒筛选的优势 | 第34页 |
| ·CpG基序作为DNA疫苗佐剂的优势 | 第34-35页 |
| ·核靶向序列(nuclear targeting sequences,DTS)对抗原表达量的影响 | 第35页 |
| ·多聚腺苷酸的作用 | 第35页 |
| ·类生物合成法构建质粒的优势 | 第35-36页 |
| 5 小结 | 第36-37页 |
| 第三章 鸭瘟DNA疫苗质粒的构建及体外表达能力检测 | 第37-50页 |
| 1 材料 | 第37-38页 |
| ·质粒、病毒、菌株及细胞 | 第37页 |
| ·主要试剂 | 第37页 |
| ·主要的仪器设备 | 第37-38页 |
| 2 方法 | 第38-42页 |
| ·抗原基因UL24、tgB(451-1670bp)及佐剂基因LTB、DuIL2的PCR扩增 | 第38-39页 |
| ·重叠PCR构建UL24-LTB、UL24-DuIL2融合基因 | 第39页 |
| ·单抗原基因及抗原与佐剂的融合基因酶切连接pkDNA疫苗载体及鉴定 | 第39页 |
| ·tUL24蛋白及tgB截断蛋白的原核表达及纯化 | 第39-40页 |
| ·兔抗tgB及tUL24截断蛋白血清的制备 | 第40页 |
| ·鸭瘟DNA疫苗质粒的体外表达能力检测 | 第40-42页 |
| 3 结果 | 第42-47页 |
| ·抗原基因UL24、tgB及佐剂基因LTB、Du1L2的PCR扩增结果 | 第42页 |
| ·重叠PCR构建UL24-LTB和UL24-Du1L2融合基因结果 | 第42-43页 |
| ·鸭瘟DNA疫苗的测序结果 | 第43页 |
| ·截断蛋白tgB(451-1650bp)及tUL24(720-1230bp)的原核表达及纯化 | 第43-45页 |
| ·琼脂糖扩散实验验证兔抗tgB和tUL24血清效价 | 第45页 |
| ·间接免疫荧光检测鸭瘟DNA疫苗质粒在COS-7细胞中的表达结果 | 第45-47页 |
| ·RT-PCR检测鸭瘟DNA疫苗质粒在COS-7细胞中的表达结果 | 第47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| ·外源囊膜糖蛋白对细菌生理特征的影响 | 第47-48页 |
| ·从蛋白及基因水平来检测鸭瘟DNA疫苗在体外细胞内的表达 | 第48页 |
| 5 小结 | 第48-50页 |
| 第四章 弱毒沙门氏菌c8276△crp/cya的构建及以此为基础的重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗的构建及鉴定 | 第50-60页 |
| 1 材料 | 第50-51页 |
| ·主要质粒、菌株及试剂 | 第50页 |
| ·主要的仪器设备 | 第50-51页 |
| 2 方法 | 第51-54页 |
| ·cya上下游基因的扩增 | 第51页 |
| ·cya上下游同源臂的融合 | 第51页 |
| ·cya上下游融合基因酶切连接pRE112质粒及鉴定 | 第51-52页 |
| ·质粒pRE112-△cya转染供体菌株 | 第52页 |
| ·在减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp基础上构建c8276△crp/cya | 第52页 |
| ·缺失株c8276△crp/cya的生化鉴定 | 第52-53页 |
| ·鸭瘟DNA疫苗质粒电转c8276△crp/cya感受态 | 第53页 |
| ·鸭瘟DNA疫苗质粒在c8276△crp/cya中的稳定性鉴定 | 第53页 |
| ·重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗的安全性鉴定 | 第53-54页 |
| 3 结果 | 第54-57页 |
| ·cya上下游基因的扩增及融合结果 | 第54页 |
| ·pRE112-△cya质粒的鉴定 | 第54-55页 |
| ·c8276△crp菌株与c7213(pRE112-△cy)结合单菌落PCR鉴定 | 第55页 |
| ·c8276△crp/cya的鉴定 | 第55-56页 |
| ·鸭瘟DNA疫苗质粒电转入c8276△crp/cya的PCR鉴定结果 | 第56页 |
| ·鸭瘟DNA疫苗质粒在c8276△crp/cya中的稳定性鉴定结果 | 第56页 |
| ·重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗的安全性鉴定结果 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-59页 |
| ·自杀质粒介导的同源重组方法构建突变株 | 第57页 |
| ·鼠伤寒沙门氏菌△crp/cya双缺失株作为疫苗载体的应用 | 第57-58页 |
| ·pkDNA质粒对c8276△crp/cya的生理特性的影响 | 第58页 |
| ·重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗的稳定性及安全性评价的意思 | 第58-59页 |
| 5 小结 | 第59-60页 |
| 第五章 麻鸭口服免疫重组c8276△crp/cya DEV-DNA疫苗的免疫效果研究 | 第60-74页 |
| 1 材料 | 第60-61页 |
| ·实验动物 | 第60页 |
| ·菌株及病毒 | 第60页 |
| ·主要试剂及配制 | 第60页 |
| ·主要的仪器设备 | 第60-61页 |
| 2 方法 | 第61-62页 |
| ·重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗口服剂量的确定 | 第61页 |
| ·动物免疫及样品采集 | 第61页 |
| ·差速离心配合蔗糖垫底的方法纯化DEV病毒颗粒 | 第61页 |
| ·包被抗原及阳性样品最佳稀释度的确定 | 第61-62页 |
| ·ELISA检测特异性抗tUL24蛋白及DEV的抗体水平应答 | 第62页 |
| ·攻毒保护试验 | 第62页 |
| 3 结果 | 第62-69页 |
| ·重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗的口服免疫 | 第62-63页 |
| ·鸭瘟病毒的细胞培养及纯化 | 第63-64页 |
| ·最佳抗原及最佳样品稀释度的确定 | 第64-65页 |
| ·间接ELISA检测血清抗tUL24蛋白和DEV的IgY滴度 | 第65-66页 |
| ·间接ELISA检测胆汁中抗tUL24蛋白和DEV的IgA滴度 | 第66-69页 |
| 4 讨论 | 第69-72页 |
| ·检测特异性IgY和IgA抗体的意义 | 第69页 |
| ·佐剂及多抗原基因同时免疫对鸭瘟DNA疫苗体液免疫的影响 | 第69-70页 |
| ·质粒载体对鸭瘟DNA疫苗体液免疫的影响 | 第70-71页 |
| ·LTB作为黏膜佐剂在促进口服鸭瘟DNA疫苗免疫效果上的优势 | 第71-72页 |
| ·多抗原基因共免疫在诱导保护力上的优势 | 第72页 |
| 5 小结 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-84页 |
| 附录 PKDNA全序列 | 第84-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
