| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-14页 |
| 目录 | 第14-18页 |
| 符号说明 | 第18-19页 |
| 前言 | 第19-25页 |
| 第一章 MIR-381和MIR-424在肾癌中表达特点及其靶基因分析 | 第25-64页 |
| 1. 材料与设备 | 第26-28页 |
| ·细胞 | 第26页 |
| ·主要试剂 | 第26-27页 |
| ·主要设备和耗材 | 第27-28页 |
| 2. 方法 | 第28-41页 |
| ·生物信息学分析 | 第28页 |
| ·细胞培养 | 第28-29页 |
| ·细胞的冻存与复苏 | 第29页 |
| ·MIR-381和MIR-424模拟物(MIMIC)的瞬时转染 | 第29-30页 |
| ·miR-381和miR-424 mimic的制备 | 第29页 |
| ·细胞准备 | 第29页 |
| ·瞬时转染模型物和对照核苷酸 | 第29-30页 |
| ·REAL TIME PCR | 第30-33页 |
| ·细胞总RNA提取 | 第30页 |
| ·提取细胞小RNA(使用miR提取试剂盒) | 第30-31页 |
| ·RNA浓度检测 | 第31页 |
| ·RNA逆转录为CDNA | 第31-32页 |
| ·Real time PCR检测 | 第32-33页 |
| ·WESTERN BLOT实验 | 第33-35页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第33页 |
| ·样本蛋白含量检测 | 第33页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第33-34页 |
| ·转膜 | 第34页 |
| ·封闭、抗体孵育和显色 | 第34-35页 |
| ·凝胶图像分析系统分析结果 | 第35页 |
| ·双荧光素酶报告基因分析 | 第35-41页 |
| ·实验分组：本实验分为如下各组分别转染：实验对照组、无义序列组(miR-NC)、转染miR-381组和miR-424组 | 第35页 |
| ·WEE1(野生型)荧光素酶报告基因载体的构建 | 第35-39页 |
| ·WEE1突变体荧光素酶报告基因载体的构建 | 第39-40页 |
| ·双荧光素酶报告系统检测miR-381和miR-424对靶基因WEE1的直接调控作用 | 第40-41页 |
| 3. 结果 | 第41-59页 |
| ·MIR-381和MIR-424靶基因的生物信息学分析 | 第41-45页 |
| ·MIR-381和MIR-424与靶基因的RNA二级结构分析 | 第45-47页 |
| ·MIR瞬时转染效率测定 | 第47页 |
| ·MIR-381和MIR-424及其靶基因WEE1的表达 | 第47-55页 |
| ·肾癌细胞株中WEE1蛋白的表达及其与MIR-381和MIR-424表达水平的相关分析 | 第55-57页 |
| ·荧光素酶报告基因活性检测分析MIR-381和MIR-424与WEE1靶向关系 | 第57-59页 |
| 4 讨论 | 第59-63页 |
| 5 小结 | 第63-64页 |
| 第二章 MIR-381和MIR-424对肾癌细胞株细胞生物学功能影响及其机制研究 | 第64-95页 |
| 1 材料 | 第65-67页 |
| ·细胞株 | 第65页 |
| ·主要试剂 | 第65-67页 |
| ·主要设备 | 第67页 |
| 2 方法 | 第67-74页 |
| ·细胞培养 | 第67-68页 |
| ·细胞的冻存与复苏 | 第68页 |
| ·MIR-381和MIR-424模拟物(MIMIC)的瞬时转染 | 第68-69页 |
| ·miR-381和miR-424 mimic的制备 | 第68页 |
| ·细胞准备 | 第68-69页 |
| ·瞬时转染模型物和对照核苷酸 | 第69页 |
| ·MIR-381和MIR-424对786-0、ACHN和HK-2细胞的MTT抑制实验 | 第69-70页 |
| ·细胞周期的检测 | 第70页 |
| ·细胞凋亡分析 | 第70-71页 |
| ·荧光酶标仪检测CASPASE3/7酶的活性 | 第71-72页 |
| ·WESTERN BLOT实验 | 第72-74页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第72页 |
| ·样本蛋白含量检测 | 第72页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第72-73页 |
| ·转膜 | 第73页 |
| ·封闭、抗体孵育和显色 | 第73-74页 |
| ·凝胶图像分析系统分析结果 | 第74页 |
| 3 结果 | 第74-90页 |
| ·MTT法检测在不同时间点转染MIR-381组和MIR-424对肾癌细胞及肾小管上皮细胞的生存率的影响 | 第74-77页 |
| ·CASPASE-3/7活性检测分析在不同时间点转染MIR-381和MIR-424对肾癌细胞及肾小管上皮细胞的CASPASE-3/7活性的影响 | 第77-80页 |
| ·细胞凋亡检测分析MIR-381和MIR-424对肾癌细胞及肾小管上皮细胞的细胞凋亡的影响 | 第80-83页 |
| ·MIR-381和MIR-424对肾癌细胞786-0细胞周期的影响 | 第83-85页 |
| ·MIR-381和MIR-424对肾癌细胞影响的机制分析 | 第85-90页 |
| ·过表达miR-381和miR-424可抑制靶基因WEE1表达并促进有丝分裂 | 第85-86页 |
| ·过表达miR-381和miR-424可抑制细胞周期“分子开关”Cdc2磷酸化 | 第86-87页 |
| ·过表达miR-381和miR-424可调控细胞凋亡 | 第87-89页 |
| ·过表达miR-381和miR-424抑制Cdc2磷酸化不依赖于MYT1和Cdc25途径 | 第89-90页 |
| 4 讨论 | 第90-94页 |
| 5 小结 | 第94-95页 |
| 第三章 MIR-381增强5-FU在肾癌细胞株中化疗敏感性及其机制研究 | 第95-128页 |
| 1 材料 | 第96-99页 |
| ·细胞株 | 第96页 |
| ·主要试剂 | 第96-98页 |
| ·主要设备 | 第98-99页 |
| 2 方法 | 第99-106页 |
| ·细胞培养 | 第99页 |
| ·细胞的冻存与复苏 | 第99页 |
| ·MIR-381模拟物(MIMIC)的瞬时转染 | 第99-100页 |
| ·miR-381 mimic的制备 | 第99页 |
| ·细胞准备 | 第99-100页 |
| ·瞬时转染miR-381 mimics和对照核苷酸 | 第100页 |
| ·MIR-381和5-FU对786-0、ACHN和HK-2细胞的MTT抑制实验 | 第100-101页 |
| ·操作步骤 | 第100-101页 |
| ·WEE1 SIRNA转染和回复实验 | 第101页 |
| ·细胞周期的检测 | 第101-102页 |
| ·流式细胞仪细胞凋亡分析 | 第102-103页 |
| ·荧光酶标仪检测CASPASE3/7酶的活性 | 第103-104页 |
| ·WESTERN BLOT实验 | 第104-106页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第104页 |
| ·样本蛋白含量检测 | 第104页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第104-105页 |
| ·转膜 | 第105页 |
| ·封闭、抗体孵育和显色 | 第105-106页 |
| ·凝胶图像分析系统分析结果 | 第106页 |
| 3 结果 | 第106-122页 |
| ·MTT法检测在不同时间点转染MIR-381对不同的5-FU浓度作用下的肾癌细胞及肾小管上皮细胞的生存率的影响 | 第106-113页 |
| ·转染miR-381对不同的5-FU浓度作用下上述细胞的的生存率影响 | 第106-109页 |
| ·联合应用5-FU和转染miR-381在不同时间点上述细胞的的生存率影响 | 第109-113页 |
| ·转染miR-381明显下调786-0细胞5-FU的IC50(半抑制浓度) | 第113页 |
| ·IR-381和5-FU对肾癌细胞及肾小管上皮细胞的CASPASE-3/7活性的影响 | 第113-117页 |
| ·细胞凋亡检测分析MIR-381和5-FU对786-0细胞凋亡的影响 | 第117-118页 |
| ·MIR-381和5-FU对肾癌细胞786-0细胞周期的影响 | 第118-120页 |
| ·WEE1回复实验及MIR-381增敏5-FU的机制 | 第120-122页 |
| 4 讨论 | 第122-127页 |
| 5 小结 | 第127-128页 |
| 结论 | 第128-129页 |
| 参考文献 | 第129-134页 |
| 综述 | 第134-141页 |
| 参考文献 | 第138-141页 |
| 攻读学位期间主要研究成果 | 第141-142页 |
| 致谢 | 第142页 |
