| 摘要 | 第1-20页 |
| ABSTRACT | 第20-22页 |
| 符号说明 | 第22-25页 |
| 创新 | 第25-27页 |
| 前言 | 第27-29页 |
| 1 目的基因的定向克隆与验证 | 第29-50页 |
| ·材料 | 第29页 |
| ·方法 | 第29-38页 |
| ·pGEX-4T-1表达载体酶切验证 | 第29-31页 |
| ·碱裂解法表达载体提取 | 第29-30页 |
| ·pGEX-4T-1表达载体单酶切 | 第30-31页 |
| ·目的基因的定向克隆 | 第31-35页 |
| ·体外扩增DREB 1A cDNA | 第31-32页 |
| ·拟南芥DREB 1A cDNA | 第31-32页 |
| ·DREB 1A cDNA的PCR | 第32页 |
| ·琼脂糖凝胶DNA片断回收纯化法 | 第32-33页 |
| ·表达载体pGEX-4T-1和目的基因双酶切 | 第33-34页 |
| ·pGEX-4T-1载体双酶切 | 第33-34页 |
| ·目的基因双酶切 | 第34页 |
| ·酶切表达载体和DREB 1A cDNA的纯化 | 第34页 |
| ·线型化表达载体的5'去磷酸基 | 第34-35页 |
| ·线型化表达载体与限制性目的片断的连接 | 第35页 |
| ·重组表达载体的验证 | 第35-38页 |
| ·氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第36页 |
| ·热击法转化大肠杆菌感受态细胞 | 第36-37页 |
| ·菌落PCR | 第37页 |
| ·重组表达载体大小的快速测定 | 第37-38页 |
| ·提取表达载体来验证重组表达载体 | 第38页 |
| ·对重组表达载体进行快速的PCR分析 | 第38页 |
| ·酶切验证重组表达载体 | 第38页 |
| ·重组表达载体中DREB 1A cDNA的测序 | 第38页 |
| ·结果与分析 | 第38-49页 |
| ·对表达载体上所用酶切位点的验证 | 第38-39页 |
| ·DREB 1A cDNA的体外扩增分析 | 第39页 |
| ·DREB 1A cDNA回收与验证分析 | 第39-40页 |
| ·DREB 1A cDNA双酶切的纯化验证分析 | 第40-41页 |
| ·表达载体pGEX-4T-1双酶切的纯化验证分析 | 第41页 |
| ·线性化表达载体pGEX-4T-15'去磷酸基团纯化验证分析 | 第41-42页 |
| ·重组表达载体转化大肠杆菌克隆菌株DH 10 B | 第42-43页 |
| ·阳性克隆的菌落PCR | 第43-44页 |
| ·重组表达载体大小的快速测定分析 | 第44-45页 |
| ·表达菌株BL21中重组表达载体的琼脂糖凝胶电泳分析 | 第45页 |
| ·克隆菌株DH 10 B中重组表达载体的琼脂糖凝胶电泳分析 | 第45-46页 |
| ·对重组表达载体进行快速的PCR分析 | 第46-47页 |
| ·重组表达载体酶切的琼脂糖凝胶电泳 | 第47页 |
| ·测序结果比对 | 第47-49页 |
| ·讨论 | 第49-50页 |
| ·所用表达载体上所用酶切位点的验证 | 第49页 |
| ·避免亚克隆 | 第49页 |
| ·重组表达载体验证时菌株的选择 | 第49-50页 |
| ·含重组表达载体的细菌菌落的鉴定 | 第50页 |
| 2 原核融合表达和包涵体的纯化 | 第50-63页 |
| ·材料 | 第50页 |
| ·方法 | 第50-57页 |
| ·原核融合表达 | 第50-53页 |
| ·重组表达载体转化表达菌株 | 第50-51页 |
| ·融合蛋白试表达 | 第51-52页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第52-53页 |
| ·主要溶液 | 第52页 |
| ·SDS-PAGE电泳实验 | 第52-53页 |
| ·融合蛋白状态的确定 | 第53-54页 |
| ·融合蛋白表达的优化 | 第54-55页 |
| ·大量表达靶蛋白 | 第55页 |
| ·包涵体的纯化 | 第55-57页 |
| ·结果与分析 | 第57-61页 |
| ·对照菌株和重组菌株的制备 | 第57页 |
| ·融合蛋白的试表达 | 第57-59页 |
| ·融合蛋白表达的优化 | 第59页 |
| ·融合蛋白以包涵体的形式存在 | 第59-60页 |
| ·融合蛋白纯化结果 | 第60-61页 |
| ·讨论 | 第61-63页 |
| ·表达系统的选择及融合蛋白表达的特点 | 第61-62页 |
| ·融合蛋白在不同部位表达的特点 | 第62页 |
| ·表达产物存在形式的确定及其纯化策略 | 第62-63页 |
| ·表达菌株的选择 | 第63页 |
| ·优化外源蛋白表达的目的 | 第63页 |
| 3 多克隆抗体的制备与ELISA检测 | 第63-80页 |
| ·材料 | 第63-64页 |
| ·方法 | 第64-69页 |
| ·融合蛋白内部凝血酶识别位点的分析 | 第64页 |
| ·融合蛋白的切割 | 第64-65页 |
| ·凝血酶母液配制 | 第65页 |
| ·融合蛋白酶切浓度的配制 | 第65页 |
| ·酶切时间和酶切温度的优化 | 第65页 |
| ·DREB 1A蛋白的回收 | 第65-66页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第66-67页 |
| ·抗原的准备 | 第66页 |
| ·乳化 | 第66-67页 |
| ·动物接种 | 第67页 |
| ·抗血清的收集和分离 | 第67页 |
| ·ELISA检测 | 第67-69页 |
| ·包被 | 第67-68页 |
| ·封闭 | 第68页 |
| ·与一抗反应 | 第68页 |
| ·与二抗反应 | 第68-69页 |
| ·显色反应 | 第69页 |
| ·结果与分析 | 第69-78页 |
| ·融合蛋白中牛凝血酶识别位点及切割产物 | 第69-76页 |
| ·融合蛋白中的5个凝血酶识别位点 | 第69页 |
| ·融合蛋白切割优化及其产物分析 | 第69-76页 |
| ·凝血酶在23℃切割融合蛋白分析 | 第69-75页 |
| ·凝血酶在16℃和28℃切割融合蛋白分析 | 第75-76页 |
| ·SDS-PAGE胶上切割DREB 1A 条带 | 第76-77页 |
| ·ELISA检测结果的分析 | 第77-78页 |
| ·讨论 | 第78-80页 |
| ·融合蛋白表达前所用蛋白酶的识别位点分析 | 第78页 |
| ·融合蛋白切割后蛋白条带的判读 | 第78-79页 |
| ·抗原的免疫原性分析 | 第79-80页 |
| 4 青霉菌干菌丝体抗病机制的NORTHERN检测 | 第80-110页 |
| ·棉花子叶RNA的提取、甲醛变性胶电泳、及RNA完整性检测 | 第80-86页 |
| ·材料 | 第80页 |
| ·方法 | 第80-85页 |
| ·青霉菌干菌丝体处理棉花幼苗 | 第80-81页 |
| ·播种SCRC21棉花种子 | 第80页 |
| ·青霉菌干菌丝体水浸出液制备 | 第80页 |
| ·处理棉花幼苗 | 第80-81页 |
| ·棉花子叶RNA提取 | 第81-82页 |
| ·RNA甲醛变性胶电泳与RNA完整性检测 | 第82-85页 |
| ·RNA甲醛变性胶制备 | 第82-83页 |
| ·RNA样品制备及点样 | 第83页 |
| ·RNA甲醛变性胶电泳及注意事项 | 第83-84页 |
| ·RNA完整性检测 | 第84-85页 |
| ·结果与分析 | 第85页 |
| ·用于棉花子叶RNA提取的棉花幼苗 | 第85页 |
| ·棉花子叶RNA的质量检测 | 第85页 |
| ·讨论 | 第85-86页 |
| ·八种cDNA探针片段的回收、放射性标记以及同源性检测 | 第86-97页 |
| ·材料 | 第86页 |
| ·方法 | 第86-93页 |
| ·八种探针片段纯化 | 第86-90页 |
| ·含八种探针片段pBS载体的提取及电泳检测 | 第86-88页 |
| ·含八种探针片段pBS载体的酶切 | 第88页 |
| ·八种PR蛋白cDNA片段的回收 | 第88-90页 |
| ·八种PR蛋白cDNA探针片段的同源性检测 | 第90-92页 |
| ·探针的荧光标记 | 第90-91页 |
| ·杂交与严谨洗膜 | 第91-92页 |
| ·八种PR蛋白cDNA探针片段的放射性标记 | 第92-93页 |
| ·结果与分析 | 第93-97页 |
| ·八种PR蛋白cDNA片段的回收 | 第93-96页 |
| ·含八种PR蛋白cDNA片段的pBS载体 | 第93-94页 |
| ·八种重组pBS载体的酶切 | 第94-95页 |
| ·八种PR-蛋白cDNA片段的回收 | 第95-96页 |
| ·八种PR-蛋白cDNA片段大小检验 | 第96页 |
| ·探针同源性检测 | 第96-97页 |
| ·讨论 | 第97页 |
| ·RNA转膜检测、NORTHERN印迹及放射性自显影 | 第97-107页 |
| ·材料 | 第97页 |
| ·方法 | 第97-101页 |
| ·甲醛变性胶中RNA的转膜、固定与检测 | 第97-99页 |
| ·甲醛变性胶中RNA的转膜 | 第97-98页 |
| ·尼龙膜上RNA的固定 | 第98页 |
| ·尼龙膜上RNA的亚甲蓝检验于脱色 | 第98-99页 |
| ·低严谨性Northern印迹 | 第99-100页 |
| ·Northern印迹体系 | 第99页 |
| ·Northern印迹操作步骤 | 第99-100页 |
| ·放射性自显影 | 第100-101页 |
| ·曝光 | 第100页 |
| ·显影 | 第100-101页 |
| ·定影 | 第101页 |
| ·结果与分析 | 第101-103页 |
| ·转膜后尼龙膜上RNA含量的亚甲蓝检测 | 第101-102页 |
| ·转膜后尼龙膜上RNA含量的EB检测 | 第102页 |
| ·转膜后甲醛变性胶上残留RN检测 | 第102-103页 |
| ·Northern印迹结果 | 第103-107页 |
| ·转膜前甲醛变性胶上RNA的EB检测 | 第103页 |
| ·转膜后尼龙膜上RNA的亚甲蓝检测 | 第103-104页 |
| ·八种探针Northern印迹结果 | 第104-107页 |
| ·探针为编码PR-1a蛋白cDNA片段的Northern印迹 | 第104页 |
| ·探针为编码PR-1b蛋白cDNA片段的Northern印迹 | 第104页 |
| ·探针为编码PR-2蛋白cDNA片段的Northern印迹 | 第104-105页 |
| ·探针为编码PR-3蛋白cDNA片段的Northern印迹 | 第105页 |
| ·探针为编码PR-4蛋白cDNA片段的Northern印迹 | 第105页 |
| ·探针为编码PR-5蛋白cDNA片段的Northern印迹 | 第105-106页 |
| ·探针为编码PR-A蛋白cDNA片段的Northern印迹 | 第106页 |
| ·探针为编码PR-B蛋白cDNA片段的Northern印迹 | 第106-107页 |
| ·讨论 | 第107-110页 |
| ·低严谨性Northern杂交 | 第107页 |
| ·PR-蛋白的研究 | 第107-108页 |
| ·信号转导途径研究 | 第108-110页 |
| 总结 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-118页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 | 第118-119页 |
| 致谢 | 第119-120页 |
| 附录 | 第120-134页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第134页 |
