| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-27页 |
| 1.细胞色素P450概况 | 第10-13页 |
| ·细胞色素P450的命名 | 第11页 |
| ·细胞色素P450的结构特征 | 第11-12页 |
| ·细胞色素P450蛋白保守和可变区域 | 第12-13页 |
| 2.细胞色素P450酶系的循环催化机制 | 第13-16页 |
| ·细胞色素P450酶系的循环催化机理 | 第13-15页 |
| ·P450酶系催化的反应类型 | 第15-16页 |
| ·细胞色素P450活性检测方法 | 第16页 |
| 3.昆虫细胞色素P450功能的研究 | 第16-18页 |
| ·昆虫细胞色素P450对内源性生理物质的代谢 | 第16页 |
| ·昆虫细胞色素P450对异源物质的代谢 | 第16-17页 |
| ·昆虫细胞色素P450结构与功能关系的研究 | 第17-18页 |
| 4.细胞色素P450基因在昆虫代谢抗性中的研究 | 第18-20页 |
| ·CYP6家族与昆虫抗药性 | 第18-19页 |
| ·细胞色素P450介导的昆虫抗药性的分子基础 | 第19-20页 |
| 5.昆虫细胞色素P450基因的异源表达系统 | 第20-27页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第20-21页 |
| ·酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统 | 第21-23页 |
| ·杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统 | 第23-24页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统 | 第24-25页 |
| ·转基因昆虫表达体系 | 第25-27页 |
| 第二章 田间棉铃虫P450基因(CYP9A12和CYP9A17v2)mRNA差异表达 | 第27-32页 |
| 1.材料与方法 | 第27-29页 |
| ·供试材料 | 第27-28页 |
| ·主要试剂 | 第28页 |
| ·总RNA提取及cDNA第一链合成 | 第28-29页 |
| ·棉铃虫总RNA提取 | 第28页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测总RNA | 第28页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第28-29页 |
| ·半定量PCR | 第29页 |
| ·半定量PCR引物 | 第29页 |
| ·半定量PCR反应体系 | 第29页 |
| 2.结果与分析 | 第29-31页 |
| ·半定量PCR结果分析 | 第29-31页 |
| 3.讨论 | 第31-32页 |
| 第三章 棉铃虫P450基因酵母表达产物对拟除虫菊酯的代谢 | 第32-42页 |
| 1.材料与方法 | 第33-36页 |
| ·化学试剂 | 第33页 |
| ·棉铃虫CYP9A12和CYP9A17v2的酵母转化 | 第33页 |
| ·PCR检测外源基因CYP9A12和CYP9A17v2mRNA在酵母诱导培养中的表达 | 第33-34页 |
| ·诱导外源基因表达 | 第34页 |
| ·酵母细胞反应酶液的提取 | 第34页 |
| ·酵母细胞裂解液对硝基苯甲醚O-脱甲基活性(PNOD)检测 | 第34-35页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第35页 |
| ·酵母表达外源基因产物对拟除虫菊酯类药剂的代谢 | 第35页 |
| ·气谱分析 | 第35-36页 |
| 2.结果 | 第36-39页 |
| ·PCR检测外源P450基因在酵母中的表达 | 第36页 |
| ·重组酵母细胞裂解液PNOD活性检测 | 第36-37页 |
| ·酵母表达外源基因产物对拟除虫菊酯类药剂的代谢 | 第37-39页 |
| ·拟除虫菊酯类药剂标准样品的气谱检测 | 第37页 |
| ·拟除虫菊酯类药剂标准曲线的建立 | 第37-38页 |
| ·重组酵母细胞裂解液对拟除虫菊酯类药剂的代谢 | 第38-39页 |
| 3.讨论 | 第39-42页 |
| 第四章 棉铃虫细胞色素P450(CYP687、CYP6AE14)酵母表达载体的构建 | 第42-55页 |
| 1.材料与方法 | 第42-48页 |
| ·供试昆虫 | 第42-43页 |
| ·化学试剂 | 第43页 |
| ·棉铃虫总RNA提取及cDNA第一链合成 | 第43页 |
| ·PCR扩增CYP687和CYP6AE14全长基因 | 第43-45页 |
| ·PCR产物回收与纯化 | 第43-44页 |
| ·质粒载体的连接反应与转化 | 第44-45页 |
| ·细菌扩大培养 | 第45页 |
| ·目标片段的检测 | 第45页 |
| ·双酶切酵母表达质粒pYES2、CYP687和CYP6AE14 | 第45-47页 |
| ·双酶切反应 | 第45-46页 |
| ·连接反应 | 第46页 |
| ·转化大肠杆菌,扩大培养 | 第46页 |
| ·质粒提取及双酶切检测 | 第46-47页 |
| ·酵母培养 | 第47-48页 |
| ·酵母菌株 | 第47页 |
| ·酵母培养基 | 第47页 |
| ·转化酵母细胞 | 第47-48页 |
| 2.结果与分析 | 第48-53页 |
| ·目标片段的获得 | 第48页 |
| ·棉铃虫CYP687和CYP6AE14基因序列分析 | 第48-50页 |
| ·CYP687和CYP6AE14表达载体的构建 | 第50-53页 |
| ·CYP687、CYP6AE14及pYES2质粒双酶切 | 第50-51页 |
| ·CYP687、CYP6AE14重组表达载体检测 | 第51-53页 |
| 3.讨论 | 第53-55页 |
| 全文总结 | 第55-56页 |
| 附录:发表的学术论文 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
