| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-25页 |
| ·研究背景、目的和意义 | 第18-20页 |
| ·研究内容和方法 | 第20-23页 |
| ·以T7 RNAP为基础的体外病毒拯救方法的建立和应用 | 第21页 |
| ·以T7 RNAP为基础的体内病毒拯救方法的建立和应用 | 第21-22页 |
| ·完全依赖真核细胞RNA聚合酶Ⅰ为基础的体内拯救系统的建立和应用 | 第22-23页 |
| ·研究现状 | 第23-25页 |
| 第二章 文献综述:RNA病毒反向遗传学系统 | 第25-66页 |
| ·前言 | 第25-26页 |
| ·RNA病毒反向遗传系统的理论基础 | 第26-41页 |
| ·正链RNA病毒反向遗传系统建立的理论基础 | 第27-28页 |
| ·负链RNA病毒反向遗传系统建立的理论基础 | 第28-30页 |
| ·应用于RNA病毒反向遗传学中的转录系统 | 第30-41页 |
| ·RNA病毒拯救系统建立的策略 | 第41-55页 |
| ·基因组全长cDNA克隆的构建以及要解决的问题 | 第41-45页 |
| ·体外转录和感染性转录本 | 第45-46页 |
| ·体内转录和感染性cDNA克隆 | 第46-49页 |
| ·利用不同转录系统的病毒拯救策略 | 第49-54页 |
| ·用于拯救病毒的转录系统 | 第54-55页 |
| ·影响感染性的参数(因素) | 第55-61页 |
| ·体外转录的影响因素 | 第55-61页 |
| ·非病毒核苷酸在子代病毒的归宿 | 第61页 |
| ·病毒拯救体系的研究进展 | 第61-66页 |
| ·以T7 RNA聚合酶为基础的病毒拯救系统的研究进展 | 第61-64页 |
| ·真核RNA聚合酶Ⅰ拯救系统研究进展 | 第64-65页 |
| ·真核RNA聚合酶Ⅱ拯救系统研究进展 | 第65-66页 |
| 第一部分 SVDV HK/70株生物学特性测定、生物信息学分析及以T7 RNA聚合酶为基础的体外拯救方法的建立 | 第66-105页 |
| 第三章 SVDV HK/70株病毒生物学特性初步鉴定 | 第66-72页 |
| ·材料和方法 | 第67-68页 |
| ·毒株、细胞与实验动物 | 第67页 |
| ·试剂与酶 | 第67页 |
| ·毒种鉴定 | 第67-68页 |
| ·病毒的致病性 | 第68页 |
| ·结果 | 第68-70页 |
| ·毒种鉴定 | 第68-70页 |
| ·病毒的致病性 | 第70页 |
| ·讨论 | 第70-72页 |
| 第四章 SVDV HK/70株基因组全长cDNA的构建和序列测定 | 第72-78页 |
| ·材料与方法 | 第72-74页 |
| ·毒株 | 第72-73页 |
| ·试剂与酶 | 第73页 |
| ·引物设计与合成 | 第73页 |
| ·RT-PCR | 第73页 |
| ·目的基因的克隆与鉴定 | 第73-74页 |
| ·HK/70株基因组全长cDNA序列的装配及测定 | 第74页 |
| ·结果 | 第74-75页 |
| ·RT-PCR的结果 | 第74页 |
| ·全长cDNA的连接及初步鉴定 | 第74-75页 |
| ·全长cDNA的序列测定及其核苷酸序列 | 第75页 |
| ·讨论 | 第75-78页 |
| 第五章 SVDV HK/70株全基因组生物信息学分析 | 第78-93页 |
| ·材料与方法 | 第79-81页 |
| ·毒株序列 | 第79-80页 |
| ·HK'1/70株序列同源性比较和序列进化分析 | 第80页 |
| ·蛋白水解位点的预测分析 | 第80页 |
| ·5'NTR和3'NTR序列特征分析 | 第80页 |
| ·SVDV结构蛋白二级结构的预测 | 第80页 |
| ·SVDV结构蛋白抗原特异性淋巴细胞抗原表位的预测 | 第80-81页 |
| ·结果 | 第81-90页 |
| ·HK/70株系统发生树分析结果 | 第81-82页 |
| ·SVDV 5'NCR序列分析结果 | 第82-83页 |
| ·3'NTR的一级结构分析 | 第83-84页 |
| ·HK/70株3'NTR的二级结构分析 | 第84-86页 |
| ·蛋白二级结构和B细胞表位的预测结果 | 第86-90页 |
| ·讨论 | 第90-93页 |
| 第六章 含有病毒全长cDNA重组质粒的稳定性分析 | 第93-97页 |
| ·材料与方法 | 第93-94页 |
| ·毒株 | 第93页 |
| ·试剂与酶 | 第93页 |
| ·RT-PCR | 第93-94页 |
| ·目的基因的克隆与鉴定 | 第94页 |
| ·含有HK/70株基因组全长cDNA序列的psVDGEM重组质粒的构建 | 第94页 |
| ·含有HK/70株基因全长cDNA的psVDVOK_(12)重组质粒构建 | 第94页 |
| ·质粒稳定性分析 | 第94页 |
| ·结果 | 第94-95页 |
| ·RT-PCR的结果 | 第94-95页 |
| ·全长cDNA的连接及初步鉴定 | 第95页 |
| ·测序结果分析 | 第95页 |
| ·讨论 | 第95-97页 |
| 第七章 SVDV HK/70株全长cDNA分子克隆感染性的鉴定 | 第97-105页 |
| ·材料和方法 | 第97-100页 |
| ·实验材料 | 第97页 |
| ·体外转录物RNA的制备 | 第97-98页 |
| ·转染IBRS-2细胞 | 第98页 |
| ·反向间接血凝鉴定试验 | 第98页 |
| ·间接免疫荧光检测病毒抗原 | 第98页 |
| ·RT-PCR法检测病毒基因组 | 第98-99页 |
| ·电子显微镜观察病毒粒子 | 第99页 |
| ·TCID_(50)实验 | 第99页 |
| ·乳鼠LD_(50)实验 | 第99-100页 |
| ·结果 | 第100-103页 |
| ·体外转录结果 | 第100页 |
| ·转染IBRS-2细胞结果 | 第100-101页 |
| ·反向间接血凝鉴定试验 | 第101页 |
| ·拯救病毒的RT-PCR鉴定 | 第101-102页 |
| ·免疫荧光检测结果 | 第102页 |
| ·电子显微镜观察结果 | 第102页 |
| ·TCID_(50)实验结果 | 第102页 |
| ·乳鼠毒力试验结果 | 第102-103页 |
| ·讨论 | 第103-105页 |
| 第二部分 以T7 RNA聚合酶为基础的体内拯救方法的建立和应用 | 第105-120页 |
| 第八章 稳定表达T7 RNA聚合酶细胞系的建立以及用该细胞系对SVDV的体内拯救 | 第105-115页 |
| ·材料与方法 | 第105-109页 |
| ·菌株、质粒与细胞 | 第106页 |
| ·酶与试剂 | 第106页 |
| ·引物设计与合成 | 第106页 |
| ·T7 RNAP基因的扩增与逆转录病毒载体的克隆 | 第106-107页 |
| ·鉴定T7 RNAP转录活性载体的构建 | 第107页 |
| ·GP2-293细胞培养与转染pT7BABEpuro | 第107页 |
| ·假型重组逆转录病毒感染宿主细胞 | 第107-108页 |
| ·不同代次的IBRST7细胞的T7 RNAP基因的PCR检测 | 第108页 |
| ·SDS-PAGE对IBRST7细胞的T7 RNAP检测 | 第108页 |
| ·T7 RNAP活性检测 | 第108页 |
| ·流式细胞仪对细胞表达水平的分析 | 第108页 |
| ·BHKT7和SK6T7细胞系的建立、筛选及活性检测 | 第108页 |
| ·SVDV的拯救 | 第108-109页 |
| ·结果 | 第109-112页 |
| ·T7 RNA聚合酶基因的扩增及克隆结果 | 第109页 |
| ·IRES基因扩增和克隆的结果 | 第109页 |
| ·egfg基因的扩增和克隆结果 | 第109-110页 |
| ·PCR扩增检测不同代次目的基因稳定性结果 | 第110页 |
| ·SDS-PAGE检测不同代次T7 RNAP | 第110-111页 |
| ·T7 RNAP活性检测结果 | 第111页 |
| ·流式细胞仪对细胞表达水平的分析 | 第111-112页 |
| ·BHKT7和SK6T7细胞系的建立、筛选及活性检测 | 第112页 |
| ·SVDv的拯救及其生物学鉴定结果 | 第112页 |
| ·讨论 | 第112-115页 |
| 第九章 用稳定表达T7 RNA聚合酶细胞系SK6T7对CSFVC株的拯救和初步鉴定 | 第115-120页 |
| ·材料和方法 | 第115-117页 |
| ·试验材料 | 第115-116页 |
| ·所用试剂及限制性酶 | 第116页 |
| ·引物的设计与合成 | 第116页 |
| ·全长cDNA模板的线性化和纯化回收 | 第116页 |
| ·细胞转染及传代 | 第116页 |
| ·全长cDNA感染性的鉴定 | 第116-117页 |
| ·结果 | 第117-119页 |
| ·RT-PCR和nested-PCR鉴定结果 | 第117页 |
| ·转染细胞的直接荧光抗体染色鉴定结果 | 第117-118页 |
| ·兔子致病性实验结果 | 第118-119页 |
| ·讨论 | 第119-120页 |
| 第三部分 以鼠源聚合酶Ⅰ系统为基础的体内拯救方法的建立和应用 | 第120-147页 |
| 第十章 用鼠源聚合酶Ⅰ系统对SVDV HK/70株拯救 | 第120-131页 |
| ·材料与方法 | 第121-125页 |
| ·菌株、质粒与细胞 | 第121页 |
| ·酶与试剂 | 第121页 |
| ·引物设计与合成 | 第121-122页 |
| ·聚合酶Ⅰ启动子和终止子片段的扩增 | 第122页 |
| ·聚合酶Ⅰ启动子和终止子片段序列分析和序列功能区的分析 | 第122页 |
| ·SVDV HK/70株全长cDNA的装配 | 第122-123页 |
| ·在IBRS-2细胞内的病毒拯救 | 第123-124页 |
| ·在鼠体内的病毒拯救 | 第124-125页 |
| ·结果 | 第125-129页 |
| ·聚合酶Ⅰ启动子和终止子片段的扩增结果 | 第125页 |
| ·聚合酶Ⅰ启动子和终止子片段序列分析和序列功能区的分析结果 | 第125-126页 |
| ·SVDV HK/70株全长cDNA的装配的结果 | 第126页 |
| ·转染IBRS-2细胞结果 | 第126-127页 |
| ·SVDV的IBRS-2拯救毒的鉴定结果 | 第127-129页 |
| ·在乳鼠体内拯救病毒的鉴定结果 | 第129页 |
| ·讨论 | 第129-131页 |
| 第十一章 用鼠源聚合酶Ⅰ系统对FMDV的拯救及初步鉴定 | 第131-138页 |
| ·材料与方法 | 第131-134页 |
| ·菌株、质粒与细胞 | 第131-132页 |
| ·酶与试剂 | 第132页 |
| ·引物设计与合成 | 第132页 |
| ·FMDV基因片段的扩增 | 第132页 |
| ·FMDV全长cDNA的装配 | 第132-133页 |
| ·在BHK-21细胞内的病毒拯救 | 第133-134页 |
| ·结果 | 第134-136页 |
| ·FMDV全长cDNA的装配的结果 | 第134页 |
| ·转染BHK-21细胞结果 | 第134-135页 |
| ·FMDV的BHK-21拯救毒的鉴定结果 | 第135-136页 |
| ·讨论 | 第136-138页 |
| 第十二章 猪水泡病标记病毒的制备和初步鉴定 | 第138-145页 |
| ·材料和方法 | 第138-140页 |
| ·菌株、质粒与细胞 | 第138-139页 |
| ·酶与试剂 | 第139页 |
| ·引物设计与合成 | 第139页 |
| ·含有5B19基因片段的扩增 | 第139页 |
| ·含有5819标记的SVDV HK/70株全长cDNA的装配 | 第139页 |
| ·转染IBRS-2细胞 | 第139-140页 |
| ·拯救病毒的鉴定 | 第140页 |
| ·结果 | 第140-143页 |
| ·含有5B19基因片段的扩增以及含有该片段全长cDNA装配的结果 | 第141页 |
| ·转染IBRS-2细胞结果 | 第141页 |
| ·拯救病毒的RT-PCR鉴定结果 | 第141-142页 |
| ·间接免疫荧光检测结果 | 第142页 |
| ·反向间接血凝鉴定试验结果 | 第142-143页 |
| ·TCID_(50)实验结果 | 第143页 |
| ·讨论 | 第143-145页 |
| 第十三章 结论 | 第145-147页 |
| 参考文献 | 第147-161页 |
| 附录 | 第161-178页 |
| 一:OIE A类疾病(OIE List A Diseases) | 第161页 |
| 三:SVDV HK/70株全基因组核苷酸序列及其序列比对结果 | 第161-178页 |
| 致谢 | 第178-180页 |
| 作者简介 | 第180-181页 |
