| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-35页 |
| 1 导言 | 第13-23页 |
| 1．1 概述 | 第13页 |
| 1．2 分子育种研究策略 | 第13-14页 |
| 1．3 主要的分子标记 | 第14-20页 |
| 1．3．1 RFLP标记 | 第14-15页 |
| 1．3．2 RAPD标记 | 第15页 |
| 1．3．3 微卫星标记 | 第15-16页 |
| 1．3．4 AFLP标记 | 第16-18页 |
| 1．3．5 PCR-SSCP | 第18-19页 |
| 1．3．6 SNP标记 | 第19-20页 |
| 1．4 分子标记在动物遗传育种中的应用 | 第20-23页 |
| 1．4．1 遗传多样性的研究 | 第20-21页 |
| 1．4．2 基因图谱的构建 | 第21页 |
| 1．4．3 猪的起源及群体亲缘关系的研究 | 第21页 |
| 1．4．4 猪的抗病育种 | 第21-22页 |
| 1．4．5 标记辅助选择 | 第22-23页 |
| 1．4．6 标记辅助导入 | 第23页 |
| 2 影响脂肪代谢的重要候选基因 | 第23-27页 |
| 2．1 心脏脂肪酸结合蛋白基因 | 第24页 |
| 2．1．1 H-FABP基因的序列分析及其定位 | 第24页 |
| 2．1．2 H-FABP基因的遗传变异 | 第24-25页 |
| 2．1．3 猪的H-BFAP基因的遗传变异及其与肌内脂肪含量的关系 | 第25页 |
| 2．2 脂肪组织脂肪酸结合蛋白基因 | 第25页 |
| 2．3 OB基因 | 第25-26页 |
| 2．4 MO4R | 第26页 |
| 2．5 过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)基因 | 第26-27页 |
| 3 HSL和 LPL是影响脂肪代谢的重要候选基因 | 第27-35页 |
| 3．1 激素敏感脂肪酶 | 第27页 |
| 3．1．1 HSL特性 | 第27-28页 |
| 3．1．2 HSL基因分子生物学的研究进展 | 第28-29页 |
| 3．1．3 HSL基因的分子结构特点 | 第29-30页 |
| 3．2 脂蛋白脂酶 | 第30页 |
| 3．2．1 特性 | 第30-31页 |
| 3．2．2 LPL基因的定位及序列分析 | 第31-32页 |
| 3．2．3 LPL基因分子生物学的研究进展 | 第32-35页 |
| 第二章 实验目的和意义 | 第35-36页 |
| 第三章 材料和方法 | 第36-46页 |
| 1 材料 | 第36-38页 |
| 1．1 试验猪群与性状测定 | 第36页 |
| 1．2 主要仪器和设备 | 第36-37页 |
| 1．3 主要试剂 | 第37页 |
| 1．4 缓冲液和常用试剂的配制 | 第37-38页 |
| 2 实验方法 | 第38-46页 |
| 2．1 猪基因组 DNA的提取 | 第38页 |
| 2．2 基因组 DNA的浓度测定和质量检测 | 第38-39页 |
| 2．3 实验引物设计 | 第39页 |
| 2．4 样品采集及猪脂肪组织总 RNA的提取 | 第39-40页 |
| 2．4．1 样品的采集 | 第39页 |
| 2．4．2 脂肪组织总 RNA的提取 | 第39-40页 |
| 2．4．3 RNA变性电泳 | 第40页 |
| 2．5 不同品种猪cDNA第一链的合成 | 第40-41页 |
| 2．5．1 RT-PCR试剂 | 第40-41页 |
| 2．5．2 RT-PCR反应体系 | 第41页 |
| 2．5．3 RT-PCR反应产物的检测 | 第41页 |
| 2．6 RT-PCR产物的回收、纯化、克隆测序 | 第41-43页 |
| 2．6．1 RT-PCR产物回收与纯化 | 第41-42页 |
| 2．6．2 RT-PCR产物的克隆 | 第42-43页 |
| 2．6．3 感受态细胞的制备 | 第43页 |
| 2．6．4 连接产物的转化 | 第43页 |
| 2．6．5 阳性克隆子鉴定及测序 | 第43页 |
| 2．7 LPL内含子3、5及 PCR-RFLP扩增引物 | 第43-45页 |
| 2．7．1 引物设计 | 第43-44页 |
| 2．7．2 PCR扩增 | 第44页 |
| 2．7．3 PCR反应条件 | 第44-45页 |
| 2．7．4 PCR产物及酶切后的检测 | 第45页 |
| 2．8 数据处理分析 | 第45-46页 |
| 2．8．1 统计软件 | 第45页 |
| 2．8．2 基因效应统计分析模型 | 第45-46页 |
| 第四章 结果与分析 | 第46-67页 |
| 4．1 脂肪组织总 RNA的提取 | 第46页 |
| 4．2 RT-PCR扩增结果 | 第46-47页 |
| 4．3 不同品种猪cDNA片段的克隆、测序及序列分析 | 第47-48页 |
| 4．4 LPL内含子3、5的扩增和序列测定 | 第48-49页 |
| 4．5 LPL内含子3、5的多态性与性状间的关系 | 第49-67页 |
| 4．5．1 LPL基因内含子3中NheI中多态性位点的遗传效应分析 | 第49-53页 |
| 4．5．2 LPL基因内含子3中EcoT22I中多态性位点的遗传效应分析 | 第53-55页 |
| 4．5．3 LPL基因内含子3中NcoI中多态性位点的遗传效应分析 | 第55-60页 |
| 4．5．4 LPL基因内含子5中AfaI中多态性位点的遗传效应分析 | 第60-64页 |
| 4．5．5 LPL基因内含子5中ScaI中多态性位点的遗传效应分析 | 第64-67页 |
| 第五章 讨论 | 第67-72页 |
| 5．1 脂肪组织 RNA的提取 | 第67页 |
| 5．2 RT-PCR及 PCR产物的克隆 | 第67-68页 |
| 5．3 关于HSL和 LPLcDNA的进化树分析 | 第68-69页 |
| 5．4 关于内含子3、5中的 SNPs | 第69-72页 |
| 第六章 结论 | 第72-73页 |
| 第七章 HSL和LPL基因的克隆表达 | 第73-87页 |
| 7．1 大肠杆菌表达系统 | 第74-76页 |
| 7．2 原核表达载体的基本类型 | 第76-77页 |
| 7．3 大肠杆菌的表达产物 | 第77-80页 |
| 7．3．1 表达产物的处理-超声波处理法 | 第77页 |
| 7．3．2 可溶性表达产物的提取 | 第77-78页 |
| 7．3．3 包涵体的形成 | 第78-79页 |
| 7．3．4 包涵体的复性和纯化 | 第79-80页 |
| 7．4 嗜甲醇酵母巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第80-86页 |
| 7．4．1 巴斯德毕赤酵母 | 第81-82页 |
| 7．4．2 表达载体 | 第82-83页 |
| 7．4．3 受体菌 | 第83页 |
| 7．4．4 表达载体与 R．pastoris基因组整合 | 第83-84页 |
| 7．4．5 巴斯德毕赤酵母表达菌株的生长 | 第84-85页 |
| 7．4．6 分泌蛋白的翻译后修饰 | 第85-86页 |
| 7．5 研究的目的意义 | 第86-87页 |
| 第八章 材料与方法 | 第87-94页 |
| 8．1 实验材料 | 第87-90页 |
| 8．1．1 载体及菌株 | 第87-88页 |
| 8．1．2 实验所用引物 | 第88-89页 |
| 8．1．3 主要药品、试剂及溶液的配制 | 第89-90页 |
| 8．1．3．1 工具酶 | 第89页 |
| 8．1．3．2 抗生素类 | 第89页 |
| 8．1．3．3 细菌培养基 | 第89页 |
| 8．1．3．4 质粒抽提 | 第89页 |
| 8．1．3．5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第89-90页 |
| 8．1．3．6 包涵体的提取相关溶液 | 第90页 |
| 8．1．3．7 其它缓冲液 | 第90页 |
| 8．2 实验方法 | 第90-94页 |
| 8．2．1 质粒的小量制备 | 第90页 |
| 8．2．2 重组质粒的鉴定 | 第90-91页 |
| 8．2．2．1 重组质粒的快速鉴定 | 第90-91页 |
| 8．2．2．2 重组质粒的酶切鉴定 | 第91页 |
| 8．2．3 诱导表达 | 第91页 |
| 8．2．4 表达蛋白的鉴定 | 第91页 |
| 8．2．4．1 重组菌菌体的裂解 | 第91页 |
| 8．2．4．2 SDS-PAGE | 第91页 |
| 8．2．5 包涵体提取 | 第91-92页 |
| 8．2．6 不可溶性表达产物的溶解和复性 | 第92页 |
| 8．2．7 SDS-PAGE电泳 | 第92页 |
| 8．2．8 LPL 酶活性测定 | 第92-94页 |
| 第九章 结果与分析 | 第94-102页 |
| 9．1 HSL和LPL基因编码序列的 PCR扩增、克隆 | 第94-95页 |
| 9．2 表达质粒的构建与鉴定 | 第95-97页 |
| 9．2．1 LPL基因的表达载体的构建 | 第95-96页 |
| 9．2．2 HSL基因的表达质粒的构建 | 第96-97页 |
| 9．3 HSL和 LPL重组菌菌体裂解物的 SDS-PAGE电泳结果 | 第97-98页 |
| 9．4 包涵体的提取及检测 | 第98-99页 |
| 9．5 LPL表达产物酶活性的检测 | 第99页 |
| 9．6 酵母表达载体的构建与鉴定 | 第99-100页 |
| 9．6．1 酵母表达引物的扩增 | 第99-100页 |
| 9．6．2 HSL和LPL目的片段与表达载体的连接 | 第100页 |
| 9．6．3 重组酵母表达载体的酶切鉴定 | 第100页 |
| 9．7 pPIC9K-HSL/pPIC9K-LPL在巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达 | 第100-101页 |
| 9．8 蛋白浓度测定 | 第101页 |
| 9．9 LPL表达产物酶活性的检测 | 第101-102页 |
| 第十章 讨论 | 第102-104页 |
| 10．1 表达产物的提取 | 第102页 |
| 10．2 影响包涵体形成的因素 | 第102页 |
| 10．3 包涵体的纯化 | 第102-103页 |
| 10．4 包涵体的溶解及复性 | 第103页 |
| 10．5 酵母表达蛋白的糖基化分析 | 第103-104页 |
| 第十一章 小结 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-117页 |
| 附录 | 第117-119页 |
| 致谢 | 第119页 |
