| 摘要 | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1. 牛发情周期内卵泡的生长发育 | 第11-15页 |
| 1.1 卵泡发育过程 | 第11页 |
| 1.2 卵泡发育波 | 第11-12页 |
| 1.3 卵泡的募集 | 第12-13页 |
| 1.4 卵泡的选择与偏差 | 第13页 |
| 1.5 卵泡的优势化 | 第13-14页 |
| 1.6 卵泡的成熟与排卵 | 第14-15页 |
| 2. 颗粒细胞对卵泡发育的影响 | 第15-17页 |
| 2.1 卵泡颗粒细胞 | 第15页 |
| 2.2 卵泡颗粒细胞与膜细胞协同作用 | 第15-16页 |
| 2.3 颗粒细胞对卵母细胞的影响 | 第16页 |
| 2.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响 | 第16-17页 |
| 3. 丝氨酸蛋白酶35 (PRSS35)研究进展 | 第17-20页 |
| 3.1 蛋白酶 | 第17-18页 |
| 3.2 丝氨酸蛋白酶 | 第18页 |
| 3.3 丝氨酸蛋白酶共同特征 | 第18页 |
| 3.4 PRSS35的发现 | 第18-19页 |
| 3.5 PRSS35的功能 | 第19-20页 |
| 4. 本研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 PRSS35基因CDS序列克隆及生物信息学分析 | 第21-35页 |
| 1 材料与方法 | 第21-26页 |
| 1.1 试验动物及样品采集 | 第21页 |
| 1.1.1 卵巢采集 | 第21页 |
| 1.1.2 颗粒细胞分离 | 第21页 |
| 1.2 试验仪器及试剂 | 第21-22页 |
| 1.2.1 主要仪器 | 第21-22页 |
| 1.2.2 主要试剂 | 第22页 |
| 1.2.3 溶液的配置 | 第22页 |
| 1.3 试验方法 | 第22-26页 |
| 1.3.1 引物设计 | 第22页 |
| 1.3.2 颗粒细胞Total RNA的提取 | 第22-23页 |
| 1.3.3 Total RNA浓度及纯度检测 | 第23页 |
| 1.3.4 反转录RT-PCR | 第23页 |
| 1.3.5 PCR扩增 | 第23-24页 |
| 1.3.6 电泳检测 | 第24页 |
| 1.3.7 PCR产物纯化 | 第24-25页 |
| 1.3.8 牛PRSS35基因克隆测序 | 第25页 |
| 1.3.9 PRSS35基因及蛋白序列生物信息学分析 | 第25-26页 |
| 2 结果与分析 | 第26-33页 |
| 2.1 牛卵泡颗粒细胞Total RNA | 第26页 |
| 2.2 牛PRSS35基因测序 | 第26-27页 |
| 2.3 牛PRSS35蛋白的生物信息学分析 | 第27-33页 |
| 2.3.1 牛PRSS35蛋白的理化性质预测 | 第27-28页 |
| 2.3.2 牛PRSS35蛋白信号肽预测 | 第28-29页 |
| 2.3.3 牛PRSS35蛋白糖基化位点以及磷酸化位点预测 | 第29-30页 |
| 2.3.4 牛PRSS35蛋白功能结构域预测 | 第30-31页 |
| 2.3.5 牛PRSS35序列相似性及聚类分析 | 第31-33页 |
| 3 讨论 | 第33-34页 |
| 4 小结 | 第34-35页 |
| 第三章 牛优势卵泡与从属卵泡的筛选 | 第35-40页 |
| 1 材料与方法 | 第35-36页 |
| 1.1 试验动物及样品采集 | 第35页 |
| 1.1.1 卵巢采集 | 第35页 |
| 1.2 试验仪器及试剂耗材 | 第35页 |
| 1.2.1 试验仪器 | 第35页 |
| 1.2.2 试验试剂及耗材 | 第35页 |
| 1.3 试验方法 | 第35-36页 |
| 1.3.1 采集卵泡液并分离颗粒细胞 | 第35页 |
| 1.3.2 雌激素和孕酮的测定 | 第35-36页 |
| 1.3.2.1 试剂的准备 | 第35-36页 |
| 1.3.2.2 检测程序 | 第36页 |
| 1.3.2.3 计算结果 | 第36页 |
| 2 结果与分析 | 第36-38页 |
| 2.1 卵泡液中雌激素和孕酮的测定 | 第36-38页 |
| 3 讨论 | 第38-39页 |
| 4 小结 | 第39-40页 |
| 第四章 PRSS35在牛卵泡颗粒细胞中的表达 | 第40-50页 |
| 1 材料与方法 | 第40-44页 |
| 1.1 试验动物及样品处理 | 第40页 |
| 1.1.1 卵巢采集 | 第40页 |
| 1.1.2 牛卵泡组织固定 | 第40页 |
| 1.1.3 液氮研磨组织 | 第40页 |
| 1.2 试验仪器及试剂耗材 | 第40-42页 |
| 1.2.1 主要仪器 | 第40-41页 |
| 1.2.2 试验试剂及耗材 | 第41页 |
| 1.2.3 溶液的配置 | 第41-42页 |
| 1.3 试验方法 | 第42-44页 |
| 1.3.1 牛卵泡组织切片制作 | 第42页 |
| 1.3.2 免疫组织化学 | 第42-43页 |
| 1.3.3 颗粒细胞Total RNA的提取 | 第43页 |
| 1.3.4 反转录RT-PCR | 第43页 |
| 1.3.5 PCR引物设计及扩增 | 第43页 |
| 1.3.6 实时荧光定量PCR(qPCR)反应 | 第43页 |
| 1.3.7 颗粒细胞Total Protein的提取 | 第43-44页 |
| 1.3.8 Western Blot反应 | 第44页 |
| 1.3.9 数据处理与分析 | 第44页 |
| 2 结果与分析 | 第44-48页 |
| 2.1 免疫组织化学结果 | 第44-46页 |
| 2.2 荧光定量引物PCR结果 | 第46页 |
| 2.3 实时荧光定量PCR(qPCR)扩增曲线与熔解曲线 | 第46-47页 |
| 2.4 实时荧光定量PCR(qPCR)结果 | 第47页 |
| 2.5 Western Blot结果 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48-49页 |
| 4 小结 | 第49-50页 |
| 第五章 PRSS35在牛卵泡颗粒细胞中的功能研究 | 第50-59页 |
| 1 材料与方法 | 第50-54页 |
| 1.1 试验动物 | 第50页 |
| 1.2 试验仪器及试剂 | 第50-51页 |
| 1.2.1 主要仪器 | 第50页 |
| 1.2.2 主要试剂 | 第50-51页 |
| 1.2.3 溶液的配置 | 第51页 |
| 1.3 试验方法 | 第51-54页 |
| 1.3.1 siRNA的设计与合成 | 第51页 |
| 1.3.2 卵泡的分离 | 第51-52页 |
| 1.3.3 卵泡颗粒细胞的分离 | 第52页 |
| 1.3.4 卵泡颗粒细胞的培养 | 第52页 |
| 1.3.5 卵泡颗粒细胞的传代与冻存 | 第52页 |
| 1.3.6 siRNA转染卵泡颗粒细胞 | 第52页 |
| 1.3.7 颗粒细胞Total RNA的提取 | 第52页 |
| 1.3.8 反转录RT-PCR | 第52-53页 |
| 1.3.9 实时荧光定量PCR(qPCR)反应 | 第53页 |
| 1.3.10 siRNA转染颗粒细胞后培养液E_2浓度测定 | 第53页 |
| 1.3.11 细胞凋亡检测 | 第53页 |
| 1.3.12 数据处理与分析 | 第53-54页 |
| 2 结果与分析 | 第54-57页 |
| 2.1 细胞转染结果 | 第54页 |
| 2.2 实时荧光定量PCR(qPCR)结果 | 第54-55页 |
| 2.3 细胞培养液中雌二醇E_2浓度检测 | 第55-56页 |
| 2.4 细胞凋亡检测结果 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-58页 |
| 4 小结 | 第58-59页 |
| 全文结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| Abstract | 第67-68页 |
| 附录 | 第69-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
