| 主要符号表 | 第8-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 第一部分 前言 | 第14-24页 |
| 1.1 克拉维酸介绍 | 第14页 |
| 1.2 克拉维酸生物合成相关的基因簇 | 第14-17页 |
| 1.2.1 克拉维酸基因簇 | 第14-16页 |
| 1.2.2 克拉维烷基因簇 | 第16页 |
| 1.2.3 旁系同源基因簇 | 第16-17页 |
| 1.3 克拉维酸的生物合成途径 | 第17-19页 |
| 1.4 克拉维酸生物合成的调控 | 第19-21页 |
| 1.4.1 途径特异性调控基因 | 第19页 |
| 1.4.2 γ-丁内酯信号途径 | 第19-20页 |
| 1.4.3 σ因子调控系统 | 第20页 |
| 1.4.4 其他调控机制 | 第20-21页 |
| 1.5 双组份信号转导系统 | 第21页 |
| 1.6 本研究拟解决的问题 | 第21-24页 |
| 第二部分 影响CA合成的调控基因 | 第24-50页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第24-30页 |
| 2.1.1 菌株 | 第24-25页 |
| 2.1.2 质粒 | 第25-26页 |
| 2.1.3 引物 | 第26-27页 |
| 2.1.4 培养基 | 第27-29页 |
| 2.1.5 主要试剂及配制 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-41页 |
| 2.2.1 链霉菌产孢培养 | 第30-31页 |
| 2.2.2 链霉菌孢子收集及保存 | 第31页 |
| 2.2.3 链霉菌总DNA提取的菌丝体培养与收集 | 第31页 |
| 2.2.4 链霉菌总DNA提取 | 第31-32页 |
| 2.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第32页 |
| 2.2.6 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第32-33页 |
| 2.2.7 DNA的琼脂糖凝胶回收 | 第33页 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第33页 |
| 2.2.9 大肠杆菌热击转化 | 第33-34页 |
| 2.2.10 基因敲除质粒构建 | 第34-38页 |
| 2.2.11 大肠杆菌与链霉菌间接合转移 | 第38-39页 |
| 2.2.12 链霉菌基因敲除突变菌株PCR筛选验证 | 第39-40页 |
| 2.2.13 CA产量的生物活性检测 | 第40页 |
| 2.2.14 链霉菌CA液体发酵培养 | 第40页 |
| 2.2.15 CA的HPLC检测 | 第40-41页 |
| 2.3 实验结果 | 第41-47页 |
| 2.3.1 链霉菌总DNA提取 | 第41-42页 |
| 2.3.2 基因敲除质粒构建 | 第42-43页 |
| 2.3.3 基因敲除菌株构建 | 第43-45页 |
| 2.3.4 基因敲除菌株的CA固体发酵及检测 | 第45-47页 |
| 2.3.5 基因敲除菌株的CA液体发酵及检测 | 第47页 |
| 2.4 讨论 | 第47-50页 |
| 第三部分 orf1717/1718对CA生物合成调控的分析 | 第50-68页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第50-53页 |
| 3.1.1 菌株 | 第50页 |
| 3.1.2 质粒 | 第50-51页 |
| 3.1.3 引物 | 第51-53页 |
| 3.1.4 培养基 | 第53页 |
| 3.1.5 主要试剂及配制 | 第53页 |
| 3.2 实验方法 | 第53-57页 |
| 3.2.1 链霉菌CA液体发酵培养与收集 | 第53页 |
| 3.2.2 pHLY-1717超表达质粒构建 | 第53-55页 |
| 3.2.3 CA的HPLC检测 | 第55页 |
| 3.2.4 转录组测序及分析 | 第55页 |
| 3.2.5 链霉菌总RNA提取 | 第55-56页 |
| 3.2.6 RT-qPCR | 第56-57页 |
| 3.3 实验结果 | 第57-66页 |
| 3.3.1 orf1717超表达菌株构建 | 第57页 |
| 3.3.2 △1717/1718和orf1717超表达菌株的液体发酵分析 | 第57-59页 |
| 3.3.3 液体发酵条件下的转录组分析 | 第59-63页 |
| 3.3.4 CA合成相关基因的RT-qPCR分析 | 第63-66页 |
| 3.4 讨论 | 第66-68页 |
| 第四部分 orf1717调控的靶基因分析 | 第68-94页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第68-74页 |
| 4.1.1 菌株 | 第68页 |
| 4.1.2 质粒 | 第68-69页 |
| 4.1.3 引物 | 第69-70页 |
| 4.1.4 培养基 | 第70-71页 |
| 4.1.5 主要试剂及配制 | 第71-74页 |
| 4.2 实验方法 | 第74-87页 |
| 4.2.1 链霉菌ChIP-seq用菌丝体培养与收集 | 第74页 |
| 4.2.2 1717 His重组蛋白的表达质粒构建 | 第74-79页 |
| 4.2.3 重组蛋白1717His的表达纯化及抗体制备 | 第79-81页 |
| 4.2.4 pSET-1717Flag融合质粒的构建 | 第81-82页 |
| 4.2.5 Westernblot(蛋白质免疫印迹)实验 | 第82-83页 |
| 4.2.6 ChIP-seq(染色质免疫共沉淀)实验 | 第83-84页 |
| 4.2.7 EMSA(凝胶迁移/凝胶阻滞电泳)实验 | 第84-87页 |
| 4.3 实验结果 | 第87-93页 |
| 4.3.1 重组蛋白1717His的表达纯化 | 第87-88页 |
| 4.3.2 棒状链霉菌1717Flag融合菌株的构建 | 第88-89页 |
| 4.3.3 棒状链霉菌中ORF1717蛋白在发酵过程中的表达情况分析 | 第89-90页 |
| 4.3.4 棒状链霉菌1717Flag融合菌株的ChIP-seq | 第90-92页 |
| 4.3.5 1717 His蛋白与启动子的EMSA分析 | 第92-93页 |
| 4.4 讨论 | 第93-94页 |
| 第五部分 结论与展望 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-102页 |
| 致谢 | 第102-104页 |
| 附录 | 第104-105页 |
