| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩写符号术语表 | 第9-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-30页 |
| 1.1 脱卤酶简介 | 第15-19页 |
| 1.1.1 脱卤酶的来源和分类 | 第15-16页 |
| 1.1.2 卤代醇脱卤酶的立体结构和催化机制 | 第16-18页 |
| 1.1.3 脱卤酶的应用 | 第18-19页 |
| 1.2 (3R，5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯概述 | 第19-23页 |
| 1.2.1 (3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的理化性质 | 第19页 |
| 1.2.2 (3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的用途 | 第19-21页 |
| 1.2.3 (3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法 | 第21-23页 |
| 1.3 酶的分子改造 | 第23-28页 |
| 1.3.1 酶的理性设计 | 第23-24页 |
| 1.3.1.1 理性设计的原理和方法 | 第23页 |
| 1.3.1.2 理性设计的研究进展 | 第23-24页 |
| 1.3.2 酶的定向进化 | 第24-28页 |
| 1.3.2.1 定向进化的背景 | 第24页 |
| 1.3.2.2 定向进化的原理 | 第24-25页 |
| 1.3.2.3 定向进化的方法 | 第25-27页 |
| 1.3.2.4 酶的高通量筛选模型的建立 | 第27页 |
| 1.3.2.5 酶定向进化的应用 | 第27-28页 |
| 1.3.3 酶的半理性设计 | 第28页 |
| 1.4 本课题的研究恩路 | 第28-30页 |
| 第二章 HHDH卤代醇脱卤酶的定向进化 | 第30-53页 |
| 2.1 前言 | 第30页 |
| 2.2 材料与实验方法 | 第30-43页 |
| 2.2.1 材料 | 第30-32页 |
| 2.2.1.1 菌种和质粒 | 第30-31页 |
| 2.2.1.2 主要实验仪器及设备 | 第31页 |
| 2.2.1.3 主要药品与试剂 | 第31页 |
| 2.2.1.4 培养基与试剂配制 | 第31-32页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第32-43页 |
| 2.2.2.1 菌种的保藏和活化 | 第33页 |
| 2.2.2.2 质粒的提取 | 第33页 |
| 2.2.2.3 1%琼脂糖凝胶电泳 | 第33页 |
| 2.2.2.4 普通PCR方法 | 第33-34页 |
| 2.2.2.5 易错PCR条件的确定 | 第34页 |
| 2.2.2.6 双酶切 | 第34-35页 |
| 2.2.2.7 酶连 | 第35页 |
| 2.2.2.8 PCR产物回收 | 第35页 |
| 2.2.2.9 E. coli感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| 2.2.2.10 转化 | 第36页 |
| 2.2.2.11 高通量筛选方法 | 第36-38页 |
| 2.2.2.12 突变文库中突变率测定 | 第38页 |
| 2.2.2.13 突变子的复筛 | 第38页 |
| 2.2.2.14 蛋白浓度的测定 | 第38页 |
| 2.2.2.15 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第38-39页 |
| 2.2.2.16 蛋白纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.2.17 酶活的测定 | 第40-41页 |
| 2.2.2.18 分子生物学软件与网络资源 | 第41-42页 |
| 2.2.2.19 定点突变 | 第42页 |
| 2.2.2.20 动力学常数的测定 | 第42-43页 |
| 2.2.2.21 分子模拟 | 第43页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第43-52页 |
| 2.3.1 易错PCR条件的确定 | 第43-44页 |
| 2.3.2 突变文库的建立 | 第44-46页 |
| 2.3.3 定向进化结果 | 第46-48页 |
| 2.3.3.1 HHDH_R的筛选 | 第46-48页 |
| 2.3.3.2 T131-T144和S180-T194片段的定向进化 | 第48页 |
| 2.3.4 酶的纯化 | 第48-49页 |
| 2.3.5 进化酶的比活力的测定 | 第49页 |
| 2.3.6 动力学参数的测定 | 第49-50页 |
| 2.3.7 突变子HHDH_R的构效关系分析 | 第50-52页 |
| 2.4 本章小结 | 第52-53页 |
| 第三章 HHDH卤代醇脱卤酶的半理性设计 | 第53-68页 |
| 3.1 引言 | 第53页 |
| 3.2 材料和方法 | 第53-55页 |
| 3.2.1 材料 | 第53页 |
| 3.2.1.1 菌种、质粒和培养基 | 第53页 |
| 3.2.1.2 主要实验仪器与设备 | 第53页 |
| 3.2.1.3 主要药品和试剂 | 第53页 |
| 3.2.2 方法 | 第53-55页 |
| 3.2.2.1 重组表达载体的构建 | 第54页 |
| 3.2.2.2 定点饱和突变文库的构建 | 第54-55页 |
| 3.2.2.3 分子模拟 | 第55页 |
| 3.2.2.4 酶的动力学常数的测定 | 第55页 |
| 3.2.2.5 酶的最适温度和稳定性的测定 | 第55页 |
| 3.2.2.6 酶的最适pH和pH稳定性的测定 | 第55页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第55-66页 |
| 3.3.1 同源建模与分子对接 | 第55-57页 |
| 3.3.2 突变位点的确定 | 第57-58页 |
| 3.3.3 突变文库的建立与筛选 | 第58-60页 |
| 3.3.4 进化酶的纯化 | 第60-61页 |
| 3.3.5 进化酶的比活力的测定 | 第61-62页 |
| 3.3.6 突变子的构效关系分析 | 第62-64页 |
| 3.3.6.1 W86I位点对酶活的影响 | 第62页 |
| 3.3.6.2 W86A位点对酶活的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.6.3 N176D位点对酶活的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.6.4 W249A位点对酶活的影响 | 第64页 |
| 3.3.7 W86I的酶学性质的表征 | 第64-66页 |
| 3.3.7.1 W86I的动力学常数的测定 | 第65页 |
| 3.3.7.2 W86I的最适温度和热稳定性 | 第65-66页 |
| 3.3.7.3 W86I最适pH和pH稳定性的测定 | 第66页 |
| 3.4 本章小结 | 第66-68页 |
| 第四章 W86I产酶条件优化和发酵工艺的研究 | 第68-80页 |
| 4.1 引言 | 第68页 |
| 4.2 材料与方法 | 第68-69页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第68-69页 |
| 4.2.1.1 实验仪器 | 第68页 |
| 4.2.1.2 主要试剂与药品 | 第68页 |
| 4.2.1.3 菌种、培养基 | 第68-69页 |
| 4.2.2 实验方法 | 第69页 |
| 4.2.2.1 摇瓶培养方法 | 第69页 |
| 4.2.2.2 分析方法 | 第69页 |
| 4.2.2.3 助溶剂的选择 | 第69页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第69-79页 |
| 4.3.1 助溶剂的选择 | 第69-70页 |
| 4.3.2 培养基的优化 | 第70-74页 |
| 4.3.2.1 不同碳源对重组菌的发酵产酶的影响 | 第70-72页 |
| 4.3.2.2 不同氮源对重组菌的发酵产酶条件的影响 | 第72-73页 |
| 4.3.2.3 不同无机盐对重组菌的发酵产酶条件的影响 | 第73-74页 |
| 4.3.3 产酶条件的优化 | 第74-79页 |
| 4.3.3.1 最适的诱导温度 | 第74-75页 |
| 4.3.3.2 最适的诱导时机 | 第75-76页 |
| 4.3.3.3 最适的诱导强度 | 第76-78页 |
| 4.3.3.4 最适的诱导时间 | 第78-79页 |
| 4.4 本章小结 | 第79-80页 |
| 第五章 结论与展望 | 第80-82页 |
| 5.1 结论 | 第80-81页 |
| 5.1.1 HHDH卤代醇脱卤酶的定向进化 | 第80页 |
| 5.1.2 HHDH卤代醇脱卤酶的半理性设计 | 第80页 |
| 5.1.3 W86I产酶条件优化和发酵工艺研究 | 第80-81页 |
| 5.2 展望 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-87页 |
| 附录 | 第87-95页 |
| 作者简介 | 第95页 |
