| 第一章 文献综述 | 第11-23页 |
| 1.1 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 | 第11-18页 |
| 1.1.1 酵母表达系统简介 | 第11页 |
| 1.1.2 表达载体的发展 | 第11-14页 |
| 1.1.2.1 载体类型 | 第12-13页 |
| 1.1.2.2 载体启动子的发展 | 第13页 |
| 1.1.2.3 信号肽的发展 | 第13-14页 |
| 1.1.3 受体菌的发展 | 第14页 |
| 1.1.4 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中高效表达的策略 | 第14-17页 |
| 1.1.4.1 外源基因本身特性对表达的影响 | 第14-15页 |
| 1.1.4.2 基因剂量 | 第15-16页 |
| 1.1.4.3 优化表达载体系统 | 第16-17页 |
| 1.1.4.4 诱导表达阶段防止蛋白降解 | 第17页 |
| 1.1.5 总结和展望 | 第17-18页 |
| 1.2 重组胰岛素的研究进展 | 第18-21页 |
| 1.2.1 胰岛素简介 | 第18-19页 |
| 1.2.2 人胰岛素原在大肠杆菌中的表达 | 第19-20页 |
| 1.2.3 人胰岛素原在酿酒酵母中的表达 | 第20页 |
| 1.2.4 人胰岛素原在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第20-21页 |
| 1.3 本论文的新颖性 | 第21-23页 |
| 第二章 人胰岛素前体(HIP)重组菌株的构建 | 第23-32页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第23页 |
| 2.1.2 限制性内切酶 | 第23页 |
| 2.1.3 其它材料 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-27页 |
| 2.2.1 pPIC9k/HIP质粒的提取 | 第24-25页 |
| 2.2.2 pPIC9k/HIP质粒浓度与纯度的测定 | 第25页 |
| 2.2.3 pPIC9k/HIP质粒的检验 | 第25-26页 |
| 2.2.4 pPIC9k/HIP质粒线性化 | 第26页 |
| 2.2.5 制备GS115感受态细胞 | 第26页 |
| 2.2.6 电转化 | 第26-27页 |
| 2.2.7 筛选his+Muts阳性克隆 | 第27页 |
| 2.2.8 G418筛选高拷贝转化子 | 第27页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第27-31页 |
| 2.3.1 pPIC9k/HIP质粒的浓度与纯度 | 第27-28页 |
| 2.3.2 pPIC9k/HIP质粒的检验 | 第28页 |
| 2.3.3 电转化及其条件的优化 | 第28-29页 |
| 2.3.4 His+Muts转化子与高拷贝转化子的筛选 | 第29-31页 |
| 本章小结 | 第31-32页 |
| 第三章 阳性克隆在摇瓶发酵过程中的分泌表达 | 第32-40页 |
| 3.1 试验材料 | 第32-33页 |
| 3.1.1 菌种 | 第32页 |
| 3.1.2 试剂 | 第32页 |
| 3.1.3 主要仪器设备 | 第32-33页 |
| 3.2 试验方法 | 第33-37页 |
| 3.2.1 人胰岛素前体在含不同拷贝数的菌株中的诱导表达 | 第33页 |
| 3.2.2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳 | 第33-37页 |
| 3.2.2.1 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳缓冲液系统的建立 | 第33-34页 |
| 3.2.2.2 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳垂直板凝胶的制备 | 第34-35页 |
| 3.2.2.3 蛋白样品的制备 | 第35-36页 |
| 3.2.2.4 蛋白样品的凝胶电泳 | 第36页 |
| 3.2.2.5 凝胶电泳的染色 | 第36-37页 |
| 3.2.3 建立高产菌株表达模式 | 第37页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第37-39页 |
| 3.3.1 人胰岛素前体在含不同拷贝数的菌株中的诱导表达 | 第37页 |
| 3.3.2 高产菌株的表达模式 | 第37-39页 |
| 本章小结 | 第39-40页 |
| 第四章 重组人胰岛素活性检测 | 第40-46页 |
| 4.1 实验材料 | 第40页 |
| 4.1 1菌种 | 第40页 |
| 4.1.2 试剂与仪器 | 第40页 |
| 4.2 实验方法 | 第40-43页 |
| 4.2.1 发酵生产人胰岛素前体 | 第40-41页 |
| 4.2.2 发酵液总蛋白的测定 | 第41-42页 |
| 4.2.2.1 Coomassie blue蛋白染色系统的建立 | 第41页 |
| 4.2.2.2 标准曲线的测定 | 第41页 |
| 4.2.2.3 发酵液样品的测定 | 第41-42页 |
| 4.2.3 人胰岛素前体的纯化与后加工 | 第42-43页 |
| 4.2.3.1 人胰岛素前体的纯化 | 第42-43页 |
| 4.2.3.2 溴化氰处理人胰岛素前体 | 第43页 |
| 4.2.3.3 羧肽酶处理人胰岛素前体 | 第43页 |
| 4.2.4 胰岛素的活性测定 | 第43页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第43-45页 |
| 4.3.1 发酵液总蛋白的测定 | 第43-44页 |
| 4.3.2 胰岛素的活性测定 | 第44-45页 |
| 本章小结 | 第45-46页 |
| 结 论 | 第46-47页 |
| 参 考 文 献 | 第47-50页 |
| 符 号 说 明 | 第50-52页 |
| 附录一 培养基 | 第52-54页 |
| 附录二 缓冲液 | 第54-55页 |
| 致 谢 | 第55-56页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第56页 |
