| 第1章 一般性引言 | 第16-21页 |
| 1．1 研究背景、基础和意义 | 第16-17页 |
| 1．2 拟解决问题及研究内容 | 第17-19页 |
| 1．3 技术路线 | 第19-21页 |
| 第2章 文献综述 | 第21-61页 |
| 2．1 动物RNA病毒的拯救及反向遗传系统 | 第21-46页 |
| 2．1．1 早期发展历史 | 第22-23页 |
| 2．1．2 一般病毒拯救体系的方法学 | 第23-29页 |
| 2．1．2．1 概述 | 第23-24页 |
| 2．1．2．2 VV/T7系统及基于T7 RNA聚合酶的替代系统 | 第24-26页 |
| 2．1．2．3 体外转录 | 第26-28页 |
| 2．1．2．4 RNA polⅡ系统 | 第28页 |
| 2．1．2．5 RNA polⅠ系统 | 第28-29页 |
| 2．1．3 正链RNA病毒的拯救 | 第29-38页 |
| 2．1．3．1 脊髓灰质炎病毒：无细胞体系的从头合成 | 第29-30页 |
| 2．1．3．2 冠状病毒：定向重组、克隆载体与系统性体外装配 | 第30-32页 |
| 2．1．3．3 黄病毒：不稳定克隆和准种特性 | 第32-35页 |
| 2．1．3．4 野田村病毒：病毒-宿主相互作用 | 第35-36页 |
| 2．1．3．5 甲病毒：从病毒拯救到病毒载体 | 第36-38页 |
| 2．1．4 负链RNA病毒的拯救 | 第38-43页 |
| 2．1．4．1 流感病毒（正粘病毒）：负链RNA病毒遗传拯救的发展见证 | 第38-40页 |
| 2．1．4．2 其它分节段RNA病毒：微基因组、双义编码 | 第40-42页 |
| 2．1．4．3 不分节段负链（NNS）RNA病毒：转录反基因组和比较反式作用蛋白 | 第42-43页 |
| 2．1．5 双链RNA病毒的拯救 | 第43-45页 |
| 2．1．5．1 双RNA病毒科 | 第43页 |
| 2．1．5．2 呼肠孤病毒科：基因组节段重配——最后的挑战 | 第43-45页 |
| 2．1．6 展望 | 第45-46页 |
| 2．2 长距离RT-PCR方法及其在RNA病毒基因组扩增上的应用 | 第46-52页 |
| 2．2．1 反转录反应 | 第47-49页 |
| 2．2．1．1 反转录酶的选择：SuperscriptⅡ | 第47页 |
| 2．2．1．2 RNA模板完整性和纯度：RT反应的关键参数 | 第47-48页 |
| 2．2．1．3 RT反应的调整和优化 | 第48-49页 |
| 2．2．2 PCR反应 | 第49-51页 |
| 2．2．2．1 引物设计 | 第49页 |
| 2．2．2．2 聚合酶 | 第49-50页 |
| 2．2．2．3 PCR循环参数及其它条件优化 | 第50-51页 |
| 2．2．2．4 PCR产物的克隆 | 第51页 |
| 2．2．3 长距离RT-PCR Vs．分段克隆再拼接 | 第51-52页 |
| 2．3 新技术防治传染性法氏囊病的研究进展和思考 | 第52-61页 |
| 2．3．1 与疫苗有关的IBDV分子生物学进展 | 第52-56页 |
| 2．3．1．1 IBDV病毒粒子的立体结构 | 第53页 |
| 2．3．1．2 VP1 | 第53页 |
| 2．3．1．3 VP5 | 第53-54页 |
| 2．3．1．4 VP3 | 第54页 |
| 2．3．1．5 VP2 | 第54-56页 |
| 2．3．1．6 嵌合IBDV | 第56页 |
| 2．3．2 新型疫苗研制 | 第56-59页 |
| 2．3．2．1 重组亚单位疫苗 | 第56-57页 |
| 2．3．2．2 病毒样颗粒（VLPs） | 第57页 |
| 2．3．2．3 重组活载体疫苗 | 第57-58页 |
| 2．3．2．4 高压力失活病毒 | 第58-59页 |
| 2．3．2．5 核酸疫苗 | 第59页 |
| 2．3．3 展望 | 第59-61页 |
| 第3章 实验材料和常规方法 | 第61-71页 |
| 3．1 病毒、菌株、细胞和基因工程载体 | 第61页 |
| 3．2 引物一览表（详见以下各章研究内容） | 第61页 |
| 3．3 主要分子生物学试剂和试剂盒 | 第61-63页 |
| 3．4 常用试剂及配制 | 第63-65页 |
| 3．5 病毒分离、纯化和基因组抽提 | 第65-67页 |
| 3．5．1 超速离心纯化病毒 | 第65-66页 |
| 3．5．2 透析袋浓缩纯化病毒 | 第66页 |
| 3．5．3 蛋白酶K／酚／氯仿法抽提病毒dsRNA基因组 | 第66-67页 |
| 3．5．4 TRIzol抽提病毒dsRNA基因组 | 第67页 |
| 3．5．5 LiCl进一步纯化dsRNA | 第67页 |
| 3．6 反转录和各类PCR方法 | 第67-71页 |
| 3．6．1 反转录（RT） | 第67-68页 |
| 3．6．2 酚／氯仿抽提RT反应液 | 第68-69页 |
| 3．6．3 常规PCR | 第69页 |
| 3．6．4 长距离PCR（Long PCR） | 第69-71页 |
| 3．6．4．1 （方案Ⅰ）采用Roche公司Expand High Fidelity PCR System | 第69-70页 |
| 3．6．4．2 （方案Ⅱ）采用TaKaRa公司One Shot LA PCR Mix | 第70-71页 |
| 3．6．5 重组PCR（融合PCR） | 第71页 |
| 3．7 基因克隆 | 第71-82页 |
| 3．7．1 PCR产物纯化 | 第71-73页 |
| 3．7．1．1 低熔点胶回收法 | 第71-72页 |
| 3．7．1．2 UNIQ-5试剂盒DNA凝胶回收法 | 第72-73页 |
| 3．7．2 双酶切定向克隆法 | 第73-74页 |
| 3．7．2．1 感受态细胞制备 | 第73页 |
| 3．7．2．2 DNA双酶切及酶切产物纯化 | 第73-74页 |
| 3．7．2．3 连接（用DNA Ligation Kit Ver．2进行） | 第74页 |
| 3．7．2．4 转化及细菌培养 | 第74页 |
| 3．7．3 T载体克隆法 | 第74-75页 |
| 3．7．4 单酶切非定向克隆法 | 第75-76页 |
| 3．7．5 重组克隆鉴定 | 第76-77页 |
| 3．7．5．1 碱裂解法小量制备质粒DNA | 第76页 |
| 3．7．5．2 异丙醇法快速提取质粒DNA | 第76-77页 |
| 3．7．5．3 酶切及PCR鉴定 | 第77页 |
| 3．7．5．4 甘油菌菌种保存 | 第77页 |
| 3．7．5．5 序列测定 | 第77页 |
| 3．8 Vero细胞培养与传代 | 第77页 |
| 3．9 病毒拯救及检测方法 | 第77-82页 |
| 3．9．1 重组质粒超纯纯化（Concert~（TM） High purity Plasmid Purification System Kit） | 第77-78页 |
| 3．9．2 转染 | 第78-79页 |
| 3．9．3 Northern RNA点杂交 | 第79-80页 |
| 3．9．3．1 细胞总RNA的提取 | 第79页 |
| 3．9．3．2 RNA点膜 | 第79页 |
| 3．9．3．3 探针标记 | 第79-80页 |
| 3．9．3．4 预杂交、杂交和洗膜 | 第80页 |
| 3．9．3．5 免疫检测 | 第80页 |
| 3．9．4 免疫荧光 | 第80-81页 |
| 3．9．5 电镜观察 | 第81-82页 |
| 第4章 长距离RT-PCR扩增并克隆IBDV浙江分离株双节段基因组 | 第82-96页 |
| 4．1 引言 | 第82页 |
| 4．2 设计思路 | 第82-83页 |
| 4．3 实验内容和结果 | 第83-94页 |
| 4．3．1 蛋白酶K／酚／氯仿法可有效抽提IBDV dsRNA基因组 | 第83-85页 |
| 4．3．2 IBDV HZ2株A节段全长基因组的一步扩增 | 第85-87页 |
| 4．3．3 用T载体克隆IBDV HZ2株A节段cDNA | 第87-90页 |
| 4．3．4 IBDV HZ2株和JD1株B节段的一步扩增和克隆 | 第90-94页 |
| 4．4 讨论 | 第94-96页 |
| 第5章 IBDV浙江分离株全基因组生物信息学分析 | 第96-110页 |
| 5．1 引言 | 第96页 |
| 5．2 所用的序列分析及生物信息学软件 | 第96页 |
| 5．3 分析与讨论 | 第96-110页 |
| 5．3．1 A节段非编码区（NCR）结构 | 第96-98页 |
| 5．3．2 A节段ORFA2及其编码的VP5蛋白 | 第98-100页 |
| 5．3．3 A节段ORFA1及其编码的VP2、VP4、VP3蛋白 | 第100-103页 |
| 5．3．4 HZ2株和JD1株B节段VP1基因在上游5′-非编码区有一个同框起始密码 | 第103-107页 |
| 5．3．5 VP1蛋白上潜在的毒力氨基酸位点分析 | 第107-110页 |
| 第6章 IBDV基因组cDNA序列的定点突变 | 第110-133页 |
| 6．1 引言 | 第110页 |
| 6．2 设计思路和实验方案 | 第110-111页 |
| 6．3 实验内容和结果 | 第111-131页 |
| 6．3．1 “Head-to-tail”A节段双价重组表达载体 | 第111-116页 |
| 6．3．2 定点突变（Ⅰ）：A节段上引入NaeI及在3′-NCR插入G；在B节段上引入EcoRV | 第116-123页 |
| 6．3．3 含有突变标记的A节段和B节段真核表达载体构建 | 第123-127页 |
| 6．3．4 定点突变（Ⅱ）：A节段上引入NaeI位点，及在3′-NCR插入C | 第127-131页 |
| 6．4 讨论 | 第131-133页 |
| 第7章 IBDV反向遗传系统的建立 | 第133-142页 |
| 7．1 引言 | 第133页 |
| 7．2 设计思路 | 第133页 |
| 7．3 实验内容和结果 | 第133-140页 |
| 7．3．1 共转染“被标记”的IBDV双节段cDNA重组子可在Vero细胞表达 | 第133-135页 |
| 7．3．2 共转染“被标记”的IBDV双节段cDNA重组子可以拯救IBDV | 第135-138页 |
| 7．3．3 A节段3′-NCR插入突变的IBDV表型 | 第138-140页 |
| 7．4 讨论 | 第140-142页 |
| 第8章 总结与展望 | 第142-146页 |
| 8．1 结论与主要创新点： | 第142-144页 |
| 8．2 研究工作意义 | 第144-145页 |
| 8．3 展望 | 第145-146页 |
| 参考文献 | 第146-155页 |
| 附录 | 第155-156页 |
