| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词索引表 | 第13-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-29页 |
| 1.1 毕赤酵母表达系统 | 第14-15页 |
| 1.1.1 毕赤酵母表达系统的发展 | 第14页 |
| 1.1.2 毕赤酵母表达系统的优点 | 第14页 |
| 1.1.3 毕赤酵母表达系统甲醇利用存在的问题 | 第14-15页 |
| 1.2 甲基营养型酵母的甲醇利用途径 | 第15页 |
| 1.3 酵母的甘油利用途径 | 第15-18页 |
| 1.4 毕赤酵母其他启动子的开发 | 第18-20页 |
| 1.4.1 诱导型启动子 | 第18-19页 |
| 1.4.2 组成型启动子 | 第19-20页 |
| 1.5 甲基营养型酵母醇氧化酶启动子的调控 | 第20-24页 |
| 1.5.1 与甲基营养型酵母醇氧化酶基因相关的碳源感受体与转运子 | 第20页 |
| 1.5.2 与甲基营养型酵母醇氧化酶基因相关的转录因子 | 第20-24页 |
| 1.6 醇氧化酶调控模型及碳源阻遏调控 | 第24-28页 |
| 1.6.1 毕赤酵母中P_(AOX1)调控模型 | 第24-25页 |
| 1.6.2 酿酒酵母中葡萄糖碳源的阻遏调控 | 第25-28页 |
| 1.7 本课题的研究背景目的及意义 | 第28-29页 |
| 第2章 毕赤酵母激酶缺失文库的构建及相关激酶的表型 | 第29-51页 |
| 2.1 前言 | 第29页 |
| 2.2 实验材料 | 第29-33页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第29页 |
| 2.2.2 培养基和培养条件 | 第29-33页 |
| 2.2.3 生物化学与分子生物学试剂 | 第33页 |
| 2.3 实验方法 | 第33-36页 |
| 2.3.1 毕赤酵母激酶敲除质粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.3.2 大肠杆菌TOP 10感受态的制备及转化 | 第34页 |
| 2.3.3 毕赤酵母感受态的制备及转化 | 第34-35页 |
| 2.3.4 毕赤酵母基因组的提取及阳性转化子菌株的验证 | 第35-36页 |
| 2.3.5 Aox酶活显色反应 | 第36页 |
| 2.3.6 激酶缺失株的点板生长 | 第36页 |
| 2.3.7 GFP表达菌株的构建 | 第36页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第36-49页 |
| 2.4.1 毕赤酵母激酶敲除结果 | 第36-41页 |
| 2.4.2 生长相关的非碳源特异性毕赤酵母激酶 | 第41-44页 |
| 2.4.3 甘油中生长特异性相关的毕赤酵母激酶 | 第44-46页 |
| 2.4.4 甲醇中生长特异性相关的毕赤酵母激酶 | 第46页 |
| 2.4.5 介导甘油对P_(AOX1)调控作用的相关激酶 | 第46-47页 |
| 2.4.6 介导甲醇对P_(AOX1)调控作用的相关激酶 | 第47-48页 |
| 2.4.7 毕赤酵母P_(AOX1)调控通路的简单分析 | 第48-49页 |
| 2.5 小结 | 第49-51页 |
| 第3章 毕赤酵母WT及△hog1的磷酸化蛋白质组分析 | 第51-60页 |
| 3.1 前言 | 第51页 |
| 3.2 实验材料 | 第51页 |
| 3.3 实验方法 | 第51-53页 |
| 3.3.1 磷酸化蛋白质组样品的制备 | 第51页 |
| 3.3.2 磷酸化蛋白质组样品蛋白的提取 | 第51-52页 |
| 3.3.3 蛋白质的酶解 | 第52页 |
| 3.3.4 磷酸化肽段的富集 | 第52-53页 |
| 3.3.5 基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MS/MS分析 | 第53页 |
| 3.3.6 Mascot搜索鉴定蛋白质 | 第53页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第53-59页 |
| 3.4.1 磷酸化位点的鉴定 | 第53-55页 |
| 3.4.2 磷酸化蛋白的鉴定 | 第55-56页 |
| 3.4.3 三个样品磷酸化鉴定结果的GO分析 | 第56-57页 |
| 3.4.4 三个样品磷酸化鉴定结果的COG分析 | 第57-58页 |
| 3.4.5 三个样品间差异化蛋白分析及Hog1蛋白可能作用底物的鉴定分析 | 第58-59页 |
| 3.5 小结 | 第59-60页 |
| 第4章 △gut1-HpGCY1-Glycerol系统作为非甲醇诱导表达系统的潜力 | 第60-69页 |
| 4.1 前言 | 第60页 |
| 4.2 实验材料 | 第60-61页 |
| 4.3 实验方法 | 第61-63页 |
| 4.3.1 △gut1-HpGCY1菌株的构建 | 第61-62页 |
| 4.3.2 Agut1-ScGCY1菌株的构建 | 第62页 |
| 4.3.3 菌株生长曲线及Aox酶活的显色 | 第62页 |
| 4.3.4 △gut1及△gut1-HpGCY1菌株总RNA的提取 | 第62-63页 |
| 4.3.5 毕赤酵母cDNA的制备及实时定量PCR检测 | 第63页 |
| 4.3.6 毕赤酵母总蛋白的提取 | 第63页 |
| 4.3.7 SDS-PAGE/Western blot分析 | 第63页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第63-68页 |
| 4.4.1 DHA是PAOX1的诱导型碳源 | 第63-64页 |
| 4.4.2 △gut1-HpGCY1可恢复菌株在甘油中的生长 | 第64-65页 |
| 4.4.3 △gut1-HpGCY1菌株的Aox酶活显色 | 第65-66页 |
| 4.4.4 甲醇代谢通路与过氧化物酶体合成相关基因的转录水平分析 | 第66-67页 |
| 4.4.5 Aox蛋白的Western blot分析 | 第67-68页 |
| 4.5 小结 | 第68-69页 |
| 第5章 △dak-DHA系统作为非甲醇诱导表达系统的潜力 | 第69-77页 |
| 5.1 前言 | 第69页 |
| 5.2 实验材料 | 第69页 |
| 5.3 实验方法 | 第69-70页 |
| 5.3.1 甲醇含量的测定 | 第69-70页 |
| 5.3.2 △gut1△dak双敲除菌株的构建 | 第70页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第70-76页 |
| 5.4.1 △dak菌株在DHA中的生长状况 | 第70-71页 |
| 5.4.2 △dak菌株的Aox酶活显色 | 第71-72页 |
| 5.4.3 甲醇代谢通路与过氧化物酶体合成相关基因的转录水平分析 | 第72-73页 |
| 5.4.4 Aox蛋白的Western blot分析 | 第73页 |
| 5.4.5 △dak菌株在甲醇及DHA中的生长 | 第73-76页 |
| 5.5 小结 | 第76-77页 |
| 第6章 △gut1-HpGCY1-Glycerol系统与△dak-DHA系统表达异源蛋白 | 第77-88页 |
| 6.1 前言 | 第77页 |
| 6.2 实验材料 | 第77-79页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第77页 |
| 6.2.2 培养基和培养条件 | 第77-78页 |
| 6.2.3 生物化学与分子生物学试剂 | 第78-79页 |
| 6.3 实验方法 | 第79-83页 |
| 6.3.1 WT-GFP,△gut1-HpGCY1-GFP与△dak-GFP菌株的构建 | 第79页 |
| 6.3.2 GFP荧光强度的测定 | 第79-80页 |
| 6.3.3 WT(P_(AOX1)-AMY),△dak(P_(AOX1)-AMY)和WT(P_(GAP)-AMY)菌株的构建 | 第80页 |
| 6.3.4 WT(P_(AOX1)-GOD)、△dak(P_(AOX1)-GOD)和WT(P_(GAP)-GOD)菌株的构建 | 第80页 |
| 6.3.5 WT(P_(AOX1)-HBsAg),△dak(P_(AOX1)-HBsAg)和WT(P_(GAP)-HBsAg)菌株的构建 | 第80-81页 |
| 6.3.6 三个异源重组蛋白的表达 | 第81页 |
| 6.3.7 葡萄糖氧化酶的酶活测定 | 第81-82页 |
| 6.3.8 淀粉酶的酶活测定 | 第82-83页 |
| 6.3.9 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的相对含量测定 | 第83页 |
| 6.4 结果与讨论 | 第83-87页 |
| 6.4.1 △gut1-HpGCY1-Glycerol系统与△dak-DHA系统GFP表达能力的比较 | 第83-84页 |
| 6.4.2 淀粉酶的表达 | 第84-85页 |
| 6.4.3 葡萄糖氧化酶的表达 | 第85-86页 |
| 6.4.4 乙型肝炎病毒表面抗原的表达 | 第86-87页 |
| 6.5 小结 | 第87-88页 |
| 第7章 结论、创新点与展望 | 第88-92页 |
| 7.1 主要结论 | 第88-89页 |
| 7.2 创新点 | 第89-90页 |
| 7.3 展望 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 攻读博士学位期间撰写的论文 | 第101-102页 |
| 附录 | 第102页 |
