| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-16页 |
| 第一部分 前言 | 第16-50页 |
| 第一章 转基因植物可饲疫苗的研究进展 | 第16-32页 |
| 1 概述 | 第16-21页 |
| ·植物可饲疫苗的作用机理 | 第17-18页 |
| ·植物可饲疫苗的优点 | 第18-19页 |
| ·能够有效地启动黏膜免疫反应 | 第18-19页 |
| ·生产成本低廉，易推广 | 第19页 |
| ·接种方式简单 | 第19页 |
| ·安全性好 | 第19页 |
| ·植物可饲疫苗研究的可行性 | 第19-20页 |
| ·植物的遗传操作简单化 | 第19页 |
| ·免疫原性和生物活性好 | 第19-20页 |
| ·绝大多数家畜以生饲料为食物 | 第20页 |
| ·人们对转基因植物的态度开始在转变 | 第20页 |
| ·植物可饲疫苗的表达系统 | 第20-21页 |
| ·抗原基因融合到核基因组的表达系统 | 第20页 |
| ·植物质体表达系统 | 第20-21页 |
| ·病毒载体瞬时表达系统 | 第21页 |
| ·植物可饲疫苗接种途径 | 第21页 |
| ·直接饲喂 | 第21页 |
| ·作为饲料添加剂 | 第21页 |
| 2 转基因植物可饲疫苗的应用研究 | 第21-28页 |
| ·动物病毒植物可饲疫苗 | 第22-26页 |
| ·猪病毒性腹泻植物疫苗 | 第22-24页 |
| ·新城疫病毒植物疫苗 | 第24页 |
| ·犬细小病毒植物疫苗 | 第24页 |
| ·牛轮状病毒植物疫苗 | 第24-26页 |
| ·兔出血症植物疫苗 | 第26页 |
| ·其它动物病毒植物疫苗 | 第26页 |
| ·动物细菌植物可饲疫苗 | 第26-28页 |
| 3 植物疫苗研究存在的问题及发展方向 | 第28-32页 |
| ·抗原蛋白的表达量和稳定性 | 第28页 |
| ·免疫有效性 | 第28-29页 |
| ·受体植物的选择 | 第29页 |
| ·重组蛋白的糖基化修饰问题 | 第29页 |
| ·生物安全性问题 | 第29-32页 |
| 第二章 口蹄疫及其疫苗的研究进展 | 第32-40页 |
| 1 口蹄疫的概况 | 第32-35页 |
| ·口蹄疫病毒的结构 | 第32页 |
| ·口蹄疫病毒的分类及其爆发特征 | 第32-33页 |
| ·口蹄疫病毒感染细胞的过程 | 第33-35页 |
| ·病毒与细胞的吸附、渗透及其脱衣壳 | 第33-35页 |
| ·病毒的翻译 | 第35页 |
| ·病毒的转录和基因复制 | 第35页 |
| ·病毒粒子的衣壳包装和成熟过程 | 第35页 |
| 2 口蹄疫病毒抗原位点的研究 | 第35-37页 |
| ·VP1 及其T、B 细胞位点 | 第35-36页 |
| ·其它结构蛋白及非结构蛋白上的T 细胞表位的研究 | 第36-37页 |
| ·结构蛋白VP2、VP3、VP4 上的T 细胞表位 | 第36页 |
| ·非结构蛋白上的 T 细胞表位的研究 | 第36-37页 |
| ·B 细胞表位的研究 | 第37页 |
| 3 口蹄疫植物可饲疫苗的研究进展 | 第37-40页 |
| ·表达VP1 基因的口蹄疫植物可饲疫苗 | 第37-38页 |
| ·表达抗原表位基因的口蹄疫肽疫苗 | 第38-39页 |
| ·表达全病毒外壳蛋白颗粒的口蹄疫植物可饲疫苗 | 第39-40页 |
| 第三章 柱花草的研究进展 | 第40-46页 |
| 1 概况 | 第40-41页 |
| ·柱花草的植物学与生物学特征 | 第40页 |
| ·柱花草的利用价值 | 第40-41页 |
| ·饲用价值 | 第40-41页 |
| ·改土效果 | 第41页 |
| 2 柱花草的组织培养 | 第41-43页 |
| 3 柱花草的遗传转化 | 第43页 |
| 4 热研2 号柱花草概述 | 第43-46页 |
| 第四章 本研究的目的意义及技术路线 | 第46-50页 |
| 1 目的、意义 | 第46-47页 |
| 2 技术路线 | 第47-50页 |
| ·FMDV VP1 基因在柱花草中的表达 | 第47-48页 |
| ·多抗原表位融合表达及抗原性分析 | 第48-50页 |
| 第二部分 以柱花草为受体的口蹄疫植物疫苗的研究 | 第50-112页 |
| 第一章 植物表达载体的构建 | 第50-60页 |
| 1 材料与方法 | 第50-58页 |
| ·材料 | 第50-51页 |
| ·菌株与质粒 | 第50页 |
| ·主要的酶和生化试剂 | 第50页 |
| ·培养基 | 第50页 |
| ·主要仪器设备 | 第50-51页 |
| ·方法 | 第51-58页 |
| ·pBIVP1 中间表达载体的构建 | 第51-54页 |
| ·重组农杆菌工程菌株的构建 | 第54-58页 |
| 2 结果与分析 | 第58-59页 |
| ·质粒TVP1 的酶切及载体的线性化 | 第58页 |
| ·PCR 鉴定重组表达载体pBIVP1 | 第58-59页 |
| ·斑点杂交鉴定农杆菌阳性转化菌株 | 第59页 |
| 3 讨论 | 第59-60页 |
| 第二章 热研2 号柱花草转化再生体系的优化 | 第60-70页 |
| 1 材料与方法 | 第60-63页 |
| ·材料 | 第60-61页 |
| ·菌株与质粒 | 第60页 |
| ·植物材料 | 第60页 |
| ·主要生化试剂 | 第60页 |
| ·主要实验仪器 | 第60页 |
| ·培养基 | 第60-61页 |
| ·方法 | 第61-63页 |
| ·无菌苗培养及外植体的获得 | 第61页 |
| ·预培养处理 | 第61页 |
| ·农杆菌侵染时有效浓度的筛选 | 第61页 |
| ·乙酰丁香酮预处理农杆菌 | 第61-62页 |
| ·柱花草植物浸提液预处理 | 第62页 |
| ·番木瓜的浸提液预处理 | 第62页 |
| ·硝酸银处理共培养基 | 第62页 |
| ·脯氨酸处理共培养基 | 第62页 |
| ·农杆菌浸入法处理外植体 | 第62页 |
| ·最佳转化条件下基因转化及转化株的DNA 检测 | 第62-63页 |
| 2 结果与分析 | 第63-67页 |
| ·预培养对柱花草外植体出芽率的影响 | 第63页 |
| ·不同浓度的农杆菌侵染对柱花草外植体出芽率的影响 | 第63-64页 |
| ·乙酰丁香酮预处理农杆菌对柱花草外植体出芽率的影响 | 第64页 |
| ·柱花草植物浸提液预处理对柱花草外植体出芽率的影响 | 第64页 |
| ·番木瓜的浸提液预处理对柱花草外植体出芽率的影响 | 第64-65页 |
| ·硝酸银处理共培养基对柱花草外植体出芽率的影响 | 第65页 |
| ·脯氨酸处理共培养基对柱花草外植体出芽率的影响 | 第65-66页 |
| ·农杆菌浸入法处理外植体对柱花草外植体出芽率的影响 | 第66页 |
| ·最佳条件下柱花草的遗传转化和转化植株的分子检测 | 第66-67页 |
| ·2×2 的卡平方(x~2)检验最佳条件下柱花草的遗传转化效率 | 第67页 |
| 3 讨论 | 第67-70页 |
| 第三章 农杆菌介导的柱花草遗传转化及转基因植株的分子检测 | 第70-82页 |
| 1 材料与方法 | 第70-77页 |
| ·材料 | 第70页 |
| ·菌株与质粒 | 第70页 |
| ·植物材料 | 第70页 |
| ·主要生化试剂 | 第70页 |
| ·主要实验仪器 | 第70页 |
| ·培养基 | 第70页 |
| ·方法 | 第70-77页 |
| ·播种 | 第70页 |
| ·Kan 抗性敏感试验 | 第70-71页 |
| ·农杆菌侵染液的制备 | 第71页 |
| ·叶盘法转化柱花草 | 第71-72页 |
| ·抗性转化株的PCR 检测 | 第72-73页 |
| ·PCR-Southern blotting 检测 | 第73页 |
| ·Southern blotting | 第73-74页 |
| ·RT-PCR 检测 | 第74-75页 |
| ·Northern blotting 检测 | 第75-77页 |
| 2 结果与分析 | 第77-80页 |
| ·柱花草Kan 抗性敏感试验 | 第77-78页 |
| ·柱花草子叶外植体出芽Kan 抗性敏感浓度 | 第77页 |
| ·柱花草组培苗生根Kan 敏感试验 | 第77-78页 |
| ·柱花草转化植株的筛选和移栽 | 第78页 |
| ·转基因柱花草植株检测 | 第78-80页 |
| ·PCR 检测 | 第78页 |
| ·PCR-Southern blotting 检测 | 第78-79页 |
| ·Southern blotting 检测 | 第79-80页 |
| ·RT-PCR 检测 | 第80页 |
| ·Northern blotting 检测 | 第80页 |
| 3 讨论 | 第80-82页 |
| 第四章 与泛素融合的FMDV VP1 多克隆抗体的制备 | 第82-98页 |
| 1 材料与方法 | 第82-92页 |
| ·材料 | 第82页 |
| ·主要的菌株与质粒 | 第82页 |
| ·主要的酶和生化试剂 | 第82页 |
| ·主要实验仪器 | 第82页 |
| ·植物材料 | 第82页 |
| ·动物材料 | 第82页 |
| ·方法 | 第82-92页 |
| ·与泛素融合的FMDV VP1 基因的表达 | 第82-88页 |
| ·融合蛋白的分离纯化 | 第88-90页 |
| ·免疫血清的制备 | 第90-91页 |
| ·免疫血清的抗体效价 | 第91-92页 |
| 2 结果与分析 | 第92-97页 |
| ·拟南芥总DNA 的提取 | 第92页 |
| ·泛素基因及口蹄疫外壳蛋白VP1 基因的扩增 | 第92页 |
| ·克隆载体pGEM-Ub、pGEM-VP1(U)、pGEM-VP1 的构建 | 第92-93页 |
| ·表达载体pET30a-Ub-VP1、pET30a-VP1 的构建 | 第93页 |
| ·工程菌株 BL21(DE3)/pET30a-VP1、BL21(DE3)/pET30a-Ub-VP1 的构 建 | 第93-94页 |
| ·目的基因在不同温度下的诱导表达 | 第94-95页 |
| ·重组Ub-VP1 融合蛋白的可溶性分析 | 第95-96页 |
| ·分离纯化 | 第96页 |
| ·免疫血清的抗体效价测定 | 第96-97页 |
| 3 讨论 | 第97-98页 |
| 第五章 转基因植株的蛋白表达分析、动物实验及遗传稳定性分析 | 第98-112页 |
| 1 材料与方法 | 第98-104页 |
| ·材料 | 第98页 |
| ·主要的酶和生化试剂 | 第98页 |
| ·植物材料 | 第98页 |
| ·动物材料 | 第98页 |
| ·方法 | 第98-104页 |
| ·播种 | 第98页 |
| ·转基因柱花草T_1代的遗传分析 | 第98-99页 |
| ·转基因植株T_1 代的Western blotting 检测 | 第99-100页 |
| ·间接ELISA 法测定转基因株系T_1 代中目标蛋白的浓度 | 第100-103页 |
| ·转基因植物T_1 代免疫动物的实验 | 第103-104页 |
| ·收集转基因柱花草的T_1 代种子 | 第104页 |
| 2 结果与分析 | 第104-110页 |
| ·转基因柱花草T_1代的遗传分析结果 | 第104-105页 |
| ·转基因植株的Western blotting 检测 | 第105-106页 |
| ·目标蛋白的浓度测定 | 第106-108页 |
| ·阳性对照标准曲线绘制 | 第106-107页 |
| ·阴性对照及目标蛋白浓度的确定 | 第107页 |
| ·总蛋白浓度的计算及蛋白相对浓度的确定 | 第107-108页 |
| ·免疫动物体内的抗体动态变化及抗体水平 | 第108-110页 |
| ·抗体的动态变化 | 第108页 |
| ·免疫小鼠抗血清的效价测定 | 第108-110页 |
| 3 讨论 | 第110-112页 |
| 第三部分 口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达的抗原性分析 | 第112-132页 |
| 1 材料与方法 | 第112-121页 |
| ·材料 | 第112页 |
| ·主要的菌株与质粒 | 第112页 |
| ·主要的酶和生化试剂 | 第112页 |
| ·主要实验仪器 | 第112页 |
| ·植物材料 | 第112页 |
| ·方法 | 第112-121页 |
| ·各抗原表位基因单链及引物的合成 | 第112-115页 |
| ·克隆基因的PCR 扩增 | 第115-116页 |
| ·各PCR 产物的克隆，转化与测序分析 | 第116-117页 |
| ·植物病毒载体的构建 | 第117-120页 |
| ·烟草的侵染 | 第120-121页 |
| ·RT-PCR 检测目的基因的转录水平 | 第121页 |
| ·点杂交及ELISA 检测目标蛋白的抗原性 | 第121页 |
| 2 结果与分析 | 第121-130页 |
| ·基因单链的合成 | 第121-122页 |
| ·各表位基因的第一次PCR 扩增结果 | 第122页 |
| ·条带1 与2，4 与5，3 与7 融合的第二次PCR 扩增 | 第122页 |
| ·1-2 与4-5 融合的第三次PCR 扩增 | 第122-123页 |
| ·1-2-4-5 与6 融合的第四次PCR 扩增 | 第123页 |
| ·克隆载体的酶切及PCR 鉴定 | 第123-124页 |
| ·病毒表达载体的构建 | 第124-128页 |
| ·pMD-T、pMD-B 大量酶切及中间载体pMD-T-T、pMD-B-T、pMD-T-T-B的构建 | 第124-125页 |
| ·pMD-T-T、pMD-B-T、pMD-T-B 大量酶切及中间载体pMD-B-T-T、pMD-T-B-T、pMD-T-T-B 的构建 | 第125页 |
| ·中间表达载体PVX-B-T-T、PVX-T-B-T、PVX-T-T-B、PVX-VP1 的构建 | 第125-128页 |
| ·各中间表达载体转化农杆菌的PCR 鉴定 | 第128页 |
| ·RT-PCR 检测目的基因的转录水平 | 第128-129页 |
| ·抗原表位基因融合表达的抗原性分析 | 第129-130页 |
| 3 讨论 | 第130-132页 |
| 第四部分 结论 | 第132-134页 |
| 1 FMDVVP1 基因对柱花草的遗传转化 | 第132-133页 |
| 2 多抗原表位融合表达的抗原性分析 | 第133-134页 |
| 第五部分 下一步的工作设想 | 第134-135页 |
| 参考文献 | 第135-147页 |
| 附录 | 第147-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
