| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 第一章 前言 | 第10-22页 |
| 1 苦瓜MAP30 蛋白功能区段缺失体研究进展 | 第10-12页 |
| ·MAP30 的生物活性 | 第10-11页 |
| ·MAP30 的结构 | 第11页 |
| ·MAP30 的重组生产 | 第11-12页 |
| ·功能区段缺失体的发现 | 第12页 |
| ·功能区段缺失体蛋白的优越性 | 第12页 |
| 2. 大肠杆菌表达系统研究进展 | 第12-20页 |
| ·表达载体 | 第13-15页 |
| ·复制子 | 第13页 |
| ·抗性标记 | 第13页 |
| ·启动子 | 第13-14页 |
| ·转录终止子 | 第14-15页 |
| ·表达宿主菌 | 第15-16页 |
| ·重组蛋白的定位表达 | 第16-19页 |
| ·细胞质表达 | 第17-18页 |
| ·以可溶形式表达 | 第17页 |
| ·以包涵体形式表达 | 第17-18页 |
| ·分泌表达 | 第18-19页 |
| ·细胞周质空间分泌表达 | 第18页 |
| ·培养基分泌表达 | 第18-19页 |
| ·细胞表面展示 | 第19页 |
| ·pET 表达系统简介 | 第19-20页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 4 实验技术路线 | 第21-22页 |
| 第二章 功能蛋白缺失体基因的亚克隆和原核表达 | 第22-44页 |
| 1 材料与方法 | 第22-35页 |
| ·材料 | 第22-23页 |
| ·菌株与质粒 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22-23页 |
| ·主要仪器 | 第23页 |
| ·方法 | 第23-35页 |
| ·引物设计与合成 | 第23-24页 |
| ·M1、M2、M3、M4 四个功能区段缺失体基因的亚克隆 | 第24-26页 |
| ·PCR 扩增四个功能区段缺失体基因 | 第24-25页 |
| ·PCR 扩增产物回收 | 第25-26页 |
| ·克隆载体的构建及鉴定 | 第26-29页 |
| ·PCR 回收产物延伸加A-Tailing | 第26页 |
| ·PCR 回收产物加A-Tailing 后与克隆载体pMD18-T Vector 的连接 | 第26-27页 |
| ·E. coli DH5α感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第27页 |
| ·重组质粒的少量提取 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第28页 |
| ·菌体PCR 筛选阳性克隆 | 第28-29页 |
| ·重组质粒的序列分析 | 第29页 |
| ·表达载体的构建及鉴定 | 第29-31页 |
| ·四缺失体基因的制备 | 第29-30页 |
| ·表达载体pET226 的制备 | 第30页 |
| ·四缺失体基因与表达载体的连接 | 第30-31页 |
| ·连接产物的转化及鉴定 | 第31页 |
| ·序列分析 | 第31页 |
| ·工程菌BL21（DE3）/pET-226-M1（M2、M3、M4）的构建与筛选 | 第31-32页 |
| ·pET-226-M1（M2、M3、M4）质粒的制备 | 第31-32页 |
| ·E. coli BL21（DE3）感受态细胞的制备及转化 | 第32页 |
| ·菌体PCR 筛选阳性克隆 | 第32页 |
| ·四缺失体基因的诱导表达 | 第32-33页 |
| ·重组蛋白SDS-PAGE 分析（汪家政，范明，2002） | 第33-34页 |
| ·最佳表达条件分析 | 第34页 |
| ·重组蛋白可溶性分析 | 第34-35页 |
| 2 结果与分析 | 第35-41页 |
| ·四个功能区段缺失体基因的亚克隆 | 第35页 |
| ·克隆载体的构建 | 第35-37页 |
| ·表达载体的构建 | 第37页 |
| ·工程菌株的构建 | 第37-38页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第38-39页 |
| ·最佳表达条件分析 | 第39-40页 |
| ·功能区段缺失体蛋白可溶性分析 | 第40-41页 |
| 3 讨论 | 第41-44页 |
| 第三章 功能区段缺失体蛋白的分离纯化 | 第44-54页 |
| 1 材料与方法 | 第44-47页 |
| ·材料 | 第44-46页 |
| ·菌株 | 第44页 |
| ·主要化学试剂 | 第44页 |
| ·溶液配方 | 第44-45页 |
| ·主要实验仪器 | 第45-46页 |
| ·方法 | 第46-47页 |
| ·工程菌的摇瓶发酵 | 第46页 |
| ·发酵液的处理 | 第46页 |
| ·重组蛋白的变性、复性 | 第46-47页 |
| ·重组蛋白M４的纯化 | 第47页 |
| 2 结果与分析 | 第47-50页 |
| ·洗涤液B 中尿素浓度的确定 | 第47-48页 |
| ·洗涤次数的确定 | 第48-49页 |
| ·变性液配方的确定 | 第49页 |
| ·复性液配方的确定 | 第49页 |
| ·重组蛋白M４的纯化 | 第49-50页 |
| 3 讨论 | 第50-54页 |
| 第四章 重组缺失体蛋白生物活性分析 | 第54-64页 |
| 1 材料与方法 | 第54-58页 |
| ·材料 | 第54-56页 |
| ·细胞株 | 第54页 |
| ·主要试剂 | 第54页 |
| ·细胞培养用液 | 第54-56页 |
| ·灭活小牛血清 | 第54页 |
| ·青霉素、链霉素(双抗液) | 第54-55页 |
| ·RPMI-1640 基础培养基 | 第55页 |
| ·RPMI-1640 血清细胞培养基 | 第55页 |
| ·Hanks 液 | 第55页 |
| ·0.25%胰蛋白酶 | 第55-56页 |
| ·主要仪器 | 第56页 |
| ·方法 | 第56-58页 |
| ·重组功能区段缺失体蛋白拓扑失活活性分析 | 第56页 |
| ·细胞培养(司徒镇强, 吴军正, 1996) | 第56-57页 |
| ·细胞复苏 | 第56-57页 |
| ·细胞传代 | 第57页 |
| ·重组功能区段缺失体蛋白复性液抗肿瘤活性分析及与MAP30 的比较 | 第57-58页 |
| ·重组功能区段缺失体蛋白的细胞毒性分析及与MAP30 的比较 | 第58页 |
| ·重组E.coli BL21（DE3）/pET-226-M3 的遗传稳定性分析 | 第58页 |
| 2 结果与分析 | 第58-62页 |
| ·拓扑失活活性分析 | 第58-59页 |
| ·抗肿瘤活性分析 | 第59页 |
| ·细胞毒性分析 | 第59-60页 |
| ·细胞形态观察 | 第60-61页 |
| ·重组蛋白M3 的遗传稳定性分析 | 第61-62页 |
| 3 讨论 | 第62-64页 |
| 第五章 结论 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
