| 中文摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 缩略语表 | 第9-10页 |
| 引言 | 第10-25页 |
| 1 CYP450研究进展 | 第10-12页 |
| ·细胞色素P450的分布与命名 | 第10页 |
| ·细胞色素P450的生物转化功能 | 第10-11页 |
| ·细胞色素P450在药物代谢中的重要性 | 第11-12页 |
| 2 多态性CYP2D6研究进展 | 第12-21页 |
| ·CYP2D6的定位、基因结构及体内分布 | 第13页 |
| ·CYP2D6的晶体结构研究 | 第13-14页 |
| ·CYP2D6的多态性研究 | 第14-19页 |
| ·CYP2D6的底物与抑制剂 | 第19页 |
| ·CYP2D6与药物相互作用 | 第19-21页 |
| 3 药物代谢体外研究模型的发展 | 第21-24页 |
| ·肝脏切片 | 第21页 |
| ·肝细胞 | 第21页 |
| ·人肝脏微粒体 | 第21-22页 |
| ·CYP450s异源表达系统 | 第22-24页 |
| 4 CYP2D6药物检测系统的发展 | 第24-25页 |
| 基本操作 | 第25-32页 |
| 1 琼脂糖凝胶电泳 | 第25-26页 |
| 2 胶回收 | 第26-27页 |
| 3 质粒抽提 | 第27页 |
| 4 CACL_2法制备感受态细胞 | 第27-28页 |
| 5 连接产物的转化 | 第28页 |
| 6 酵母电转化 | 第28-29页 |
| 7 SDS-PAGE与WESTERN BLOT分析 | 第29-31页 |
| 8 微粒体蛋白含量测定(BRADFORD法) | 第31页 |
| 9 P450含量的分光光度法测定 | 第31页 |
| 10 微粒体制备 | 第31-32页 |
| 实验内容 | 第32-54页 |
| 一、CYP2D6原型及突变体重组酶的表达和纯化 | 第32-44页 |
| 1 材料 | 第32-37页 |
| ·载体和菌株 | 第32-33页 |
| ·主要试剂 | 第33-34页 |
| ·溶液配制 | 第34-35页 |
| ·培养基配方 | 第35-37页 |
| ·主要仪器 | 第37页 |
| 2 方法 | 第37-40页 |
| ·CYP2D6 prototype(2D6-WT)cDNA模板的获取 | 第37页 |
| ·PCR引物的设计 | 第37页 |
| ·2D6-WT基因的扩增 | 第37-38页 |
| ·定点突变获得CYP2D6单核苷酸突变株的cDNA | 第38页 |
| ·重组载体pYES2/CT-CYP2D6的构建 | 第38-39页 |
| ·重组质粒的鉴定及测序分析 | 第39页 |
| ·重组酵母菌株yCY107-CYP2D6的构建 | 第39页 |
| ·重组酵母菌株的小量诱导表达 | 第39页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE和Western Blot分析 | 第39-40页 |
| ·重组酵母菌株yCY107-CYP2D6的大量诱导表达 | 第40页 |
| ·微粒体的制备与裂解条件的优化 | 第40页 |
| ·微粒体蛋白浓度与CYP2D6含量的测定 | 第40页 |
| 3 结果 | 第40-43页 |
| ·2D6-WT基因的扩增 | 第40-41页 |
| ·8个单核苷酸突变的引入 | 第41-42页 |
| ·重组载体pYES2/CT-CYP2D6的构建及鉴定 | 第42页 |
| ·重组酵母菌株的构建和诱导表达 | 第42-43页 |
| ·微粒体制备与裂解条件的优化 | 第43页 |
| 4 讨论 | 第43-44页 |
| ·表达系统的选择 | 第43-44页 |
| ·表达产物的分析 | 第44页 |
| 二、CYP2D6重组酶的酶学分析和高通量药物抑制实验 | 第44-54页 |
| 1 材料 | 第44-45页 |
| ·主要试剂 | 第44-45页 |
| ·溶液配制 | 第45页 |
| ·主要仪器 | 第45页 |
| 2 方法 | 第45-46页 |
| ·酶学分析 | 第45-46页 |
| ·药物抑制实验 | 第46页 |
| ·数据分析 | 第46页 |
| 3 结果 | 第46-50页 |
| ·酶学分析 | 第47-49页 |
| ·药物抑制实验 | 第49-50页 |
| 4 讨论 | 第50-54页 |
| ·检测系统的选择 | 第50页 |
| ·酶学分析 | 第50-52页 |
| ·药物抑制性分析 | 第52-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-64页 |
| 已发表文章 | 第64页 |
