用毕赤酵母系统表达XA21-LRR及其糖基化的初步研究
| 1 引言 | 第1-13页 |
| ·研究意义 | 第9-10页 |
| ·细胞膜糖蛋白的信号识别作用 | 第10-11页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优点 | 第11-13页 |
| 2 材料和方法 | 第13-27页 |
| ·试验材料 | 第13-17页 |
| ·质粒和菌株 | 第13页 |
| ·工具酶、主要试剂及用品 | 第13页 |
| ·仪器与设备 | 第13-14页 |
| ·试剂配制 | 第14-17页 |
| ·毕赤酵母表达常用母液及缓冲液配制 | 第14页 |
| ·毕赤酵母表达培养基配制 | 第14-15页 |
| ·冻融法制备毕赤酵母基因组DNA | 第15页 |
| ·Western Blot所用试剂 | 第15-17页 |
| ·试验方法 | 第17-27页 |
| ·载体选择和引物设计 | 第17-18页 |
| ·载体的选择 | 第17页 |
| ·引物设计 | 第17-18页 |
| ·目的基因的获得与纯化 | 第18-19页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第18-19页 |
| ·PCR产物纯化 | 第19页 |
| ·载体和目的片段的酶切与连接反应 | 第19-21页 |
| ·PCR产物和载体pPIC9K酶切 | 第19页 |
| ·质粒载体酶切 | 第19-20页 |
| ·载体去磷酸化 | 第20页 |
| ·载体脱磷效率检测 | 第20-21页 |
| ·目的片段与载体连接 | 第21页 |
| ·连接产物的转化 | 第21-22页 |
| ·细菌电击感受态细胞的制备 | 第21页 |
| ·连接产物的电击转化 | 第21-22页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第22页 |
| ·重组质粒的测序分析 | 第22页 |
| ·转化毕赤酵母 | 第22-23页 |
| ·用于酵母化学转化法感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| ·重组载体的酶切 | 第23页 |
| ·转化毕赤酵母 | 第23页 |
| ·用PCR方法验证重组载体 | 第23-24页 |
| ·重组基因在酵母中的小量诱导表达 | 第24-25页 |
| ·表达产物的分析与鉴定 | 第25-26页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第25页 |
| ·表达产物的Western-blot鉴定 | 第25-26页 |
| ·表达产物的糖苷酶处理及糖链鉴定 | 第26-27页 |
| 3 结果与分析 | 第27-36页 |
| ·目的基因的扩增 | 第27页 |
| ·重组载体构建的鉴定 | 第27-29页 |
| ·重组载体构建理论分析 | 第27-28页 |
| ·鉴定目的片段插入的正确方向 | 第28-29页 |
| ·重组载体构建结果 | 第29页 |
| ·重组载体的测序及结果分析 | 第29-30页 |
| ·重组载体在毕赤酵母基因组的整合情况鉴定 | 第30-33页 |
| ·MD平板筛选重组转化子 | 第30页 |
| ·YPD-G418筛选高拷贝重组转化子 | 第30页 |
| ·PCR鉴定重组转化子 | 第30-33页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及鉴定 | 第33-34页 |
| ·SDS-PAGE检测目的蛋白表达 | 第33页 |
| ·Western Blot检测目的蛋白表达 | 第33-34页 |
| ·重组蛋白的糖链分析 | 第34-36页 |
| 4 讨论 | 第36-40页 |
| ·信号肽识别位点的设计 | 第36页 |
| ·PCR产物酶切保护碱基的设计 | 第36-37页 |
| ·密码子的偏好性原则 | 第37页 |
| ·目的蛋白表达量低的原因及提高表达水平的措施 | 第37-38页 |
| ·HIS标签的作用 | 第38-39页 |
| ·LRR区糖蛋白分析 | 第39-40页 |
| 5 结论 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-45页 |
| 附录 | 第45-48页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第48-49页 |
| 作者简历 | 第49-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 中国农学通报 | 第51-58页 |
