| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-9页 |
| 前言 | 第9-12页 |
| 文献综述 | 第12-23页 |
| 萜类和萜类代谢途径 | 第12-13页 |
| 鲨烯合成酶的分离纯化及性质 | 第13页 |
| 鲨烯合成酶基因克隆 | 第13-15页 |
| 鲨烯合成酶基因表达与调控 | 第15-17页 |
| 鲨烯合成酶的反应机理与动力学 | 第17-19页 |
| 鲨烯合成酶的晶体结构 | 第19-22页 |
| 鲨烯合成酶基因进化的系统树 | 第22-23页 |
| 材料与方法 | 第23-42页 |
| 一． 实验材料与试剂 | 第23-25页 |
| 1．真菌材料 | 第23页 |
| 2． 供试培养基 | 第23页 |
| 3． 酶和试剂 | 第23-25页 |
| 3．1 DNA抽提buffer | 第23页 |
| 3．2 RNA抽提buffer | 第23-24页 |
| 3．3 Western blotting中所用的溶液 | 第24页 |
| 3．4 蛋白电泳有关试剂 | 第24页 |
| 3．5 核酸电泳溶液 | 第24-25页 |
| 3．6 质粒提取试剂和溶液 | 第25页 |
| 3．7 感受态细胞制备溶液 | 第25页 |
| 3．8 菌株和质粒 | 第25页 |
| 3．9 限制性内切酶 | 第25页 |
| 二． 实验方法 | 第25-42页 |
| （一） 灵芝鲨烯合成酶基因片段的克隆 | 第25-29页 |
| 1． PCR扩增获得灵芝鲨烯合成酶基因片段 | 第25-28页 |
| 1．1 灵芝基因组DNA的提取 | 第25-26页 |
| 1．2 设计引物 | 第26页 |
| 1．3 PCR扩增反应 | 第26-27页 |
| 1．4 CR扩增产物的回收 | 第27-28页 |
| 2． PCR扩增片段的克隆 | 第28页 |
| 2．1 目的片段与T载体的连接 | 第28页 |
| 2．2 化学法制备高效大肠杆菌感受态细胞 | 第28页 |
| 2．3 细菌的转化 | 第28页 |
| 3． 重组子的鉴定 | 第28-29页 |
| 3．1 重组质粒的提取 | 第28-29页 |
| 3．2 重组质粒的酶切鉴定 | 第29页 |
| 4． 克隆质粒T—SQ的DNA序列测定 | 第29页 |
| （二） 灵芝菌丝体cDNA文库的构建 | 第29-35页 |
| 1． 芝菌丝体总RNA的提取 | 第30-31页 |
| 2． T—PCR | 第31-32页 |
| 3． 灵芝总RNA中的mRNA的快速分离纯化 | 第32页 |
| 4． 灵芝cDNA的快速构建 | 第32-34页 |
| 5． cDNA文库的扩增 | 第34-35页 |
| （三） 鲨烯合成酶蛋白片段的抗体制备 | 第35-40页 |
| 1． 鲨烯合成酶保守肽段相应核苷酸片段的合成 | 第35页 |
| 2． 融合蛋白表达载体的构建 | 第35-38页 |
| 2．1 合成片段的酶切 | 第35-36页 |
| 2．2 pET32α（+）质粒的酶切 | 第36页 |
| 2．3 片段与pET32α（+）质粒的连接 | 第36-37页 |
| 2．4 细菌的转化 | 第37页 |
| 2．5 插入片段的检测 | 第37页 |
| 2．6 质粒pET-SQ转化表达菌株BL21（DE3） | 第37-38页 |
| 2．7 菌落鉴定 | 第38页 |
| 2．8 克隆片段的序列测定 | 第38页 |
| 3． 融合蛋白的表达 | 第38-39页 |
| 4． 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第39页 |
| 5． 融合蛋白的大量制备 | 第39-40页 |
| 6． 抗体的制备 | 第40页 |
| 7． 抗体的检测—ELISA | 第40页 |
| （四） Western Blotting检测灵芝鲨烯合成酶表达情况 | 第40-42页 |
| 1． 灵芝鲨烯合成酶粗蛋白的提取 | 第40-41页 |
| 2． 灵芝不同时期的鲨烯合成酶Western Blotting检测 | 第41-42页 |
| 实验结果 | 第42-55页 |
| 一． 鲨烯合成酶基因片段克隆实验中所用引物 | 第42页 |
| 二． 鲨烯合成酶基因片段的克隆及分析 | 第42-50页 |
| （一） 鲨烯合成酶基因片段的克隆 | 第42-46页 |
| 1． PCR、PCR产物回收 | 第42-43页 |
| 2． 重组质粒的鉴定 | 第43-44页 |
| 3． 灵芝鲨烯合成酶基因片段序列 | 第44页 |
| 4． 灵芝鲨烯合成酶基因片段序列的分析 | 第44-46页 |
| （二） 鲨烯合成酶基因片段的同源性比较 | 第46-48页 |
| 1． 灵芝鲨烯合成酶基因片段序列与别的物种鲨烯合成酶基因两两序列比较 | 第46-47页 |
| 2． 灵芝鲨烯合成酶基因片段序列与另十种物种的鲨烯合成酶基因多序列比较 | 第47-48页 |
| （三） 灵芝鲨烯合成酶基因的系统发育进化树 | 第48-50页 |
| 三． 鲨烯合成酶保守区合成、融合蛋白载体的构建、抗体制备 | 第50-53页 |
| （一） 融合蛋白载体的构建 | 第51-52页 |
| 1． 鲨烯合成酶保守肽段设计和融合蛋白载体的构建 | 第51页 |
| 2． 融合蛋白载体的鉴定 | 第51-52页 |
| （二） 融合蛋白的表达与SDS-PAGE的鉴定 | 第52页 |
| （三） 抗体的制备及ELSLA检测 | 第52-53页 |
| 四、 不同时期的灵芝鲨烯合成酶表达特性初步分析 | 第53-55页 |
| 附图： 与11种物种的鲨烯合成酶氨基酸序列同源性比较的部分结果 | 第55-61页 |
| 1． 与裂殖酵母鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第55页 |
| 2． 与芽殖酵母鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第55-56页 |
| 3． 与假丝酵母鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第56页 |
| 4． 与人鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第56-57页 |
| 5． 与老鼠鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第57页 |
| 6． 与芪草鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第57页 |
| 7． 与甘草鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第57-58页 |
| 8． 与烟草鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第58页 |
| 9． 与拟南芥鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第58-59页 |
| 10． 与葡萄鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第59页 |
| 11． 与玉米鲨烯合成酶氨基酸同源性比较 | 第59-61页 |
| 讨论 | 第61-65页 |
| 一． 鲨烯合成酶基因片段的克隆 | 第61-62页 |
| 二． 灵芝鲨烯合成酶基因片段的同源性比较与进化树 | 第62-63页 |
| 三． 融合蛋白的表达与抗体的制备 | 第63-64页 |
| 四． 灵芝鲨烯合成酶的不同时期的表达情况初步分析 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-72页 |
| 名词缩写 | 第72-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
