| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 英文缩略词及中文对照表 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-32页 |
| 引言 | 第17-18页 |
| 1. 几丁质酶的研究进展 | 第18-29页 |
| ·几丁质酶系组成 | 第18-19页 |
| ·几丁质酶的分子结构 | 第19-22页 |
| ·信号肽序列 | 第20页 |
| ·催化域 | 第20页 |
| ·几丁质结合区(CHBD) | 第20-21页 |
| ·富含Ser/Thr 区和C 端序列 | 第21-22页 |
| ·几丁质酶的性质 | 第22-23页 |
| ·产几丁质酶的微生物 | 第23页 |
| ·几丁质酶基因克隆 | 第23-24页 |
| ·几丁质酶基因的表达调控 | 第24-25页 |
| ·几丁质酶基因的表达转化 | 第25-27页 |
| ·几丁质酶基因的应用 | 第27-29页 |
| ·几丁质酶降解产物的应用 | 第27页 |
| ·在生物防治中的应用 | 第27-28页 |
| ·用于植物病原真菌的生物防治 | 第27-28页 |
| ·用于抗病基因工程 | 第28页 |
| ·在调节生命代谢活动中的应用 | 第28页 |
| ·在生物学研究方面的应用 | 第28-29页 |
| 2. 本研究的目的和内容 | 第29-32页 |
| ·研究目的和意义 | 第29-30页 |
| ·研究内容 | 第30页 |
| ·技术路线 | 第30-32页 |
| 第二章 嗜热毛壳菌热稳定几丁质酶基因的克隆及序列分析 | 第32-76页 |
| 1. 材料和方法 | 第32-47页 |
| ·材料 | 第32-34页 |
| ·供试菌株 | 第32页 |
| ·菌株与质粒 | 第32页 |
| ·酶和生化试剂 | 第32页 |
| ·仪器 | 第32-33页 |
| ·培养基 | 第33页 |
| ·溶液配制 | 第33-34页 |
| ·嗜热毛壳菌CT2 几丁质酶基因的cDNA 克隆 | 第34-46页 |
| ·引物设计 | 第34页 |
| ·总RNA 的提取( Trizol 法) | 第34-35页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第35-36页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的分离 | 第36-42页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的扩增 | 第36页 |
| ·PCR 产物回收 | 第36-38页 |
| ·与载体连接 | 第38-39页 |
| ·E.coli 感受态细胞的制备和转化 | 第39-40页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第39页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第39-40页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第40-42页 |
| ·IPTG-X-gal 筛选 | 第40页 |
| ·菌落PCR 检测 | 第40-41页 |
| ·碱法小量提取质粒DNA | 第41页 |
| ·质粒DNA 的酶切鉴定 | 第41-42页 |
| ·序列测定 | 第42页 |
| ·嗜热毛壳菌几丁质酶基因3’末端的分离（3’-RACE） | 第42页 |
| ·嗜热毛壳菌几丁质酶基因5’末端的分离（5’-RACE） | 第42-46页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第42-43页 |
| ·cDNA 第一链的纯化 | 第43页 |
| ·cDNA 第一链的加尾 | 第43-44页 |
| ·RACE-PCR 扩增 | 第44-45页 |
| ·二次PCR（巢式PCR） | 第45-46页 |
| ·目的基因全长cDNA 的克隆 | 第46页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第46页 |
| ·嗜热毛壳菌几丁质酶基因DNA 的克隆及序列分析 | 第46-47页 |
| ·菌丝体DNA 的抽提（CTAB 法） | 第46-47页 |
| ·嗜热毛壳菌几丁质酶基因DNA 的PCR 扩增 | 第47页 |
| ·嗜热毛壳菌几丁质酶基因DNA 的序列分析 | 第47页 |
| 2. 结果与分析 | 第47-68页 |
| ·嗜热毛壳菌总RNA 的提取 | 第47-48页 |
| ·嗜热毛壳菌几丁质酶基因cDNA 的分离 | 第48-64页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因cDNA 中间片段的分离 | 第48-49页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因cDNA3’末端的分离及序列分析 | 第49-51页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因cDNA 5’末端的分离 | 第51-52页 |
| ·C. thermophilum几丁质酶基因全长cDNA 的分离及扩增片段的序列拼接 | 第52-53页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因的cDNA 和氨基酸序列分析 | 第53-64页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因的cDNA 序列分析 | 第55-56页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因的氨基酸序列分析 | 第56-63页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因的结构预测 | 第63-64页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因的跨膜区预测 | 第63页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因的三级结构预测 | 第63-64页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因DNA 的扩增 | 第64-68页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶DNA 基因序列分析 | 第66-68页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶DNA 基因的核苷酸序列分析 | 第68页 |
| 3 讨论 | 第68-76页 |
| ·小结 | 第68-69页 |
| ·基因分离技术 | 第69-74页 |
| ·菌丝总RNA 的提取 | 第69-70页 |
| ·PCR 引物设计 | 第70页 |
| ·分离基因的技术 | 第70-74页 |
| ·RACE 技术 | 第70-73页 |
| ·热不对称交错PCR(TAIL-PCR) | 第73-74页 |
| ·后续工作的展望 | 第74-76页 |
| 第三章 嗜热毛壳菌几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第76-117页 |
| 1. 材料和方法 | 第76-93页 |
| ·材料 | 第76-79页 |
| ·菌株和质粒 | 第76-77页 |
| ·酶和生化试剂 | 第77页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第77-78页 |
| ·主要仪器设备 | 第78-79页 |
| ·实验方法 | 第79-93页 |
| ·Chaetomium thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的分离 | 第79-80页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析 | 第79页 |
| ·引物设计和C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的分离 | 第79-80页 |
| ·几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第80-88页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第80页 |
| ·线性化质粒DNA 的制备 | 第80-82页 |
| ·线性化酶切 | 第80-81页 |
| ·线状质粒DNA 的脱磷酸化处理 | 第81-82页 |
| ·酵母转化 | 第82-83页 |
| ·Pichia pastoris G5115 感受态细胞的制备（电击法） | 第82页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K | 第82-83页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第83-84页 |
| ·酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选 | 第83页 |
| ·酵母基因组DNA 的分离 | 第83-84页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第84-86页 |
| ·pPIC9K AOX1 通用引物鉴定 | 第84-85页 |
| ·chit 基因的特异性引物鉴定 | 第85-86页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第86-87页 |
| ·酵母工程菌的培养和几丁质酶的诱导分泌表达 | 第87页 |
| ·表达产物的分离纯化 | 第87-88页 |
| ·粗酶液的制备 | 第87页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第87页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第87-88页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第88-89页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第88-89页 |
| ·0-100μg/mL 标准曲线的制作 | 第88页 |
| ·0-1000μg/mL 标准曲线的制作 | 第88页 |
| ·考马斯亮蓝G-250 试剂的配制 | 第88-89页 |
| ·样品蛋白质浓度的测定 | 第89页 |
| ·蛋白质纯度鉴定 | 第89-90页 |
| ·电泳操作步骤 | 第89-90页 |
| ·蛋白质分子量的测定 | 第90页 |
| ·SDS-PAGE 法测定蛋白质分子量 | 第90页 |
| ·凝胶电泳方法参照《生物化学实验技术》进行 | 第90页 |
| ·电泳迁移率的计算和标准曲线的制作 | 第90页 |
| ·分子量测定 | 第90页 |
| ·凝胶过滤层析法 | 第90页 |
| ·几丁质酶表达产物的生物学活性检测 | 第90-92页 |
| ·N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）标准曲线的建立 | 第90-91页 |
| ·表达产物几丁质酶的SDS-PAGE 分析 | 第91-92页 |
| ·几丁质酶工程菌产酶曲线的测定 | 第92页 |
| ·几丁质酶工程菌的遗传稳定性分析 | 第92页 |
| ·几丁质酶工程菌表达产物的酶学性质 | 第92-93页 |
| ·反应最适温度 | 第92页 |
| ·反应最适pH 值 | 第92页 |
| ·热稳定性 | 第92-93页 |
| ·pH 值稳定性 | 第93页 |
| ·不同金属离子对几丁质酶活性的影响 | 第93页 |
| ·几种变性剂和蛋白抑制剂对几丁质酶活性的影响 | 第93页 |
| 2. 结果与分析 | 第93-108页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的分离 | 第93-95页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析结果 | 第93-95页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶成熟肽基因序列的分离 | 第95页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因chit 在毕赤酵母中的表达 | 第95-108页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第95-99页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/chit转化Pichia pastoris GS115及酵母转化子的筛选 | 第99-101页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第99页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第99-101页 |
| ·chit 基因多拷贝整合子的筛选 | 第101页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶chit 基因在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第101-103页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶chit 基因在Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选 | 第101-102页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶酵母工程菌产酶曲线的测定 | 第102页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶基因表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第102-103页 |
| ·C. thermophilum 几丁质酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第103页 |
| ·表达几丁质酶CHIT 的纯化与酶学性质研究 | 第103-108页 |
| ·表达几丁质酶CHIT 的纯化 | 第103-104页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第103-104页 |
| ·表达产物几丁质酶CHIT 的最适反应温度 | 第104-105页 |
| ·表达产物几丁质酶CHIT 的最适反应pH 值 | 第105-106页 |
| ·表达产物几丁质酶CHIT 的热稳定性 | 第106页 |
| ·表达产物几丁质酶CHIT 的pH 稳定性 | 第106-107页 |
| ·金属离子对表达产物几丁质酶CHIT 活性的影响 | 第107页 |
| ·变性剂和蛋白酶抑制剂对表达产物几丁质酶CHIT 几丁质酶活性的影响 | 第107-108页 |
| 3 讨论 | 第108-117页 |
| ·小结 | 第108-110页 |
| ·表达重组几丁质酶的Pichia pastoris 表达系统评析 | 第110-116页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统高效表达重组几丁质酶的优势 | 第110-111页 |
| ·影响Pichia pastoris 表达系统表达重组几丁质酶的因素.. | 第111-115页 |
| ·摇瓶培养与发酵罐培养 | 第115-116页 |
| ·后续工作展望 | 第116-117页 |
| 第四章 结论和展望 | 第117-119页 |
| ·结论 | 第117页 |
| ·展望 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-130页 |
| 致谢 | 第130页 |
