| 目录 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第9-11页 |
| 英文摘要 | 第11-14页 |
| 前言 | 第14-32页 |
| 1.副溶血弧菌的流行状况简介 | 第14-16页 |
| 2.VP的生物学特性 | 第16-17页 |
| 3.VP的血清分型 | 第17-18页 |
| 4.VP的毒力因子及致病机理 | 第18-26页 |
| ·耐热直接溶血毒素 | 第18-20页 |
| ·耐热相关溶血毒素 | 第20-21页 |
| ·不耐热溶血毒素 | 第21页 |
| ·尿素酶 | 第21页 |
| ·粘附因子 | 第21页 |
| ·Ⅲ型分泌系统 | 第21-26页 |
| 5.DNA芯片转录谱技术在微生物基因调控研究中的应用 | 第26-28页 |
| ·DNA芯片技术简介 | 第26-27页 |
| ·细菌适应外界环境的转录组研究 | 第27-28页 |
| ·病原菌菌转录组学研究现状 | 第28页 |
| 6.本研究的立题依据与目的意义 | 第28-32页 |
| 第一章 VP全基因组DNA芯片的研制 | 第32-38页 |
| 1.前言 | 第32页 |
| 2.材料和方法 | 第32-35页 |
| ·实验菌株 | 第33页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第33页 |
| ·基因挑选 | 第33页 |
| ·引物设计 | 第33-34页 |
| ·基因的PCR扩增 | 第34页 |
| ·纯化扩增产物 | 第34页 |
| ·芯片点样 | 第34-35页 |
| 3.结果 | 第35页 |
| 4.讨论 | 第35-38页 |
| 第二章 冷诱导条件下的VP基因转录表达的时相分析 | 第38-58页 |
| 1.前言 | 第38页 |
| 2.材料与方法 | 第38-39页 |
| ·实验菌株 | 第38-39页 |
| ·MV-5培养基 | 第39页 |
| ·细菌在10-15℃下的生长状况测定 | 第39页 |
| ·细菌的冷休克处理 | 第39页 |
| 3.DNA芯片转录谱分析的实验设计 | 第39-43页 |
| ·双色荧光实验的重复原则和荧光交换 | 第39-40页 |
| ·VP总RNA的提取 | 第40-42页 |
| ·菌体收集和RNA固定 | 第40-41页 |
| ·沉淀核酸 | 第41页 |
| ·去除DNA | 第41页 |
| ·沉淀RNA | 第41-42页 |
| ·RNA质量监控 | 第42页 |
| ·逆转录生成氨基标记的cDNA | 第42页 |
| ·氨基标记cDNA纯化 | 第42页 |
| ·氨基标记cDNA的荧光素标记与纯化 | 第42页 |
| ·芯片杂交 | 第42-43页 |
| ·片的紫外交联与醛基封闭 | 第43页 |
| ·片的预杂交 | 第43页 |
| ·芯片的杂交与漂洗 | 第43页 |
| ·数据分析 | 第43页 |
| 4.实时定量反转录PCR | 第43-47页 |
| ·挑选验证基因并设计引物 | 第44页 |
| ·Trizol提取细菌RNA的方法 | 第44-45页 |
| ·Ambion's DNA-free~(TM) kit去DNA污染 | 第45页 |
| ·逆转录生产cDNA模板 | 第45-46页 |
| ·绘制相对标准曲线和定量PCR的验证 | 第46页 |
| ·芯片数据与RT-PCR数据的相关性分析 | 第46-47页 |
| 5.引物延伸实验 | 第47-49页 |
| ·引物延伸实验的原理介绍 | 第47页 |
| ·与靶基因mRNA互补引物的设计 | 第47页 |
| ·总RNA的提取 | 第47页 |
| ·寡核苷酸探针的制备 | 第47-48页 |
| ·引物延伸反应 | 第48页 |
| ·测序反应 | 第48-49页 |
| 6.结果与讨论 | 第49-57页 |
| ·DNA芯片分析的总体概述 | 第49-50页 |
| ·不同调控基因的功能分类 | 第50-52页 |
| ·各个时相数据的聚类分析 | 第52-54页 |
| ·实时定量反转录PCR对芯片数据的验证 | 第54页 |
| ·cspA基因在冷诱导条件下的表达 | 第54-55页 |
| ·冷热休克基因的拮抗调控作用 | 第55页 |
| ·选定的其它的冷诱导基因 | 第55-57页 |
| 7.结论 | 第57-58页 |
| 第三章 低盐条件下的VP的基因转录表达分析 | 第58-72页 |
| 1.前言 | 第58-59页 |
| 2.材料与方法 | 第59-61页 |
| ·实验菌株 | 第59页 |
| ·MV-5培养基 | 第59页 |
| ·细菌在不同盐浓度下的生长曲线测定 | 第59页 |
| ·细菌的低盐环境条件的构建 | 第59-61页 |
| ·低盐:完整培养 | 第59-60页 |
| ·低盐:shift培养 | 第60-61页 |
| 3.结果与讨论 | 第61-67页 |
| ·总体概述 | 第61页 |
| ·最小低盐刺激元的建立 | 第61-63页 |
| ·相容性渗透物的合成与转运 | 第61-62页 |
| ·主要外膜蛋白的重塑 | 第62-63页 |
| ·最小低盐刺激元小结 | 第63页 |
| ·低盐shift培养条件下的基因转录变化分析 | 第63-65页 |
| ·低盐完整培养条件下的基因转录变化分析 | 第65-66页 |
| ·实时定量反转录PCR对芯片数据的验证 | 第66-67页 |
| ·VP1008和feoA(VP0857)基因在低盐诱导条件下的表达 | 第67页 |
| 结论 | 第67-72页 |
| 第四章 酸刺激条件下的副溶血弧菌的基因转录表达分析 | 第72-79页 |
| 1.前言 | 第72页 |
| 2.材料与方法 | 第72-74页 |
| ·实验菌株 | 第72页 |
| ·MV-5培养基 | 第72页 |
| ·细菌在不同pH培养环境下的生长曲线测定 | 第72-73页 |
| ·细菌的两种不同pH环境生长条件的构建 | 第73-74页 |
| ·细菌预培养 | 第73页 |
| ·pH=5.8 | 第73页 |
| ·pH=4.0 | 第73-74页 |
| 3.结果与讨论 | 第74-77页 |
| ·总体概述 | 第74页 |
| ·"shift"的培养条件下全基因组DNA芯片的比较转录谱分析 | 第74-75页 |
| ·"continuous"的培养条件下全基因组DNA芯片的比较转录谱分析 | 第75-77页 |
| 结论 | 第77-79页 |
| 第五章 各胁迫环境条件下比较转录表达谱数据的聚类分析 | 第79-90页 |
| 1.前言 | 第79页 |
| 2.数据汇总方法 | 第79-80页 |
| 3.结果与讨论 | 第80-90页 |
| ·结果 | 第80页 |
| ·讨论 | 第80-90页 |
| ·总体概述 | 第80-84页 |
| ·低温和低盐及酸性环境条件下一些亚类基因的聚类变化分析 | 第84-90页 |
| 第六章 牛磺胆酸钠盐刺激下的副溶血弧菌的全基因组比较转录谱表达分析 | 第90-100页 |
| 1.前言 | 第90-91页 |
| 2.材料与方法 | 第91-93页 |
| ·实验菌株 | 第91页 |
| ·MV-5培养基 | 第91页 |
| ·细菌在不同TCA浓度下的生长曲线测定 | 第91-92页 |
| ·细菌的TCA生长环境条件的构建 | 第92-93页 |
| ·TCA:完整培养 | 第92页 |
| ·TCA:Shift培养 | 第92-93页 |
| 3.结果与讨论 | 第93-98页 |
| ·总体概述 | 第93-94页 |
| ·"Shift"的培养条件下全基因组DNA芯片的比较转录谱分析 | 第94页 |
| ·"continuous"的培养条件下全基因组DNA芯片的比较转录谱分析 | 第94-96页 |
| ·"Shift"和"continuous"的培养条件下的转录谱聚类比较分析 | 第96-98页 |
| 结论 | 第98-100页 |
| 参考文献 | 第100-107页 |
| 附录 | 第107-165页 |
| 1.本实验研究所涉及主要仪器设备等 | 第107页 |
| 2.本实验研究所涉及主要试剂等 | 第107-108页 |
| 3.本实验研究所涉及一些试剂的配制等 | 第108-112页 |
| 4.附表 | 第112-165页 |
| 附表S1 本实验研究所用引物 | 第112-113页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(A簇) | 第113-116页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(B簇) | 第116-118页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(C簇) | 第118-120页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(D簇) | 第120-122页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(E簇) | 第122-123页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(F簇) | 第123-126页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(G簇) | 第126-128页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(H簇) | 第128-130页 |
| 附表S2 VP冷处理三个不同时间点的基因归簇(I簇) | 第130-133页 |
| 附表S3 VP低盐"shift"培养条件下基因变化分析(上调基因) | 第133-136页 |
| 附表S3 VP低盐"shift"培养条件下基因变化分析(下调基因) | 第136-138页 |
| 附表S4 VP低盐"continuous"培养条件下基因变化分析(上调基因) | 第138-142页 |
| 附表S4 VP低盐"continuous"培养条件下基因变化分析(下调基因) | 第142-146页 |
| 附表S5 VP酸性环境中"shift"培养条件下的基因变化分析(上调基因) | 第146-147页 |
| 附表S5 VP酸性环境中"shift"培养条件下的基因变化分析(下调基因) | 第147-149页 |
| 附表S6 VP酸性环境中"continuous"培养条件下的基因变化分析(上调基因) | 第149-152页 |
| 附表S6 VP酸性环境中"continuous"培养条件下的基因变化分析(下调基因) | 第152-155页 |
| 附表S7 VP添加TCA后"shift"培养条件下的基因变化分析(上调基因) | 第155-157页 |
| 附表S7 VP添加TCA后"shift"培养条件下的基因变化分析(下调基因) | 第157-158页 |
| 附表S8 VP添加TCA后"continuous"培养条件下的基因变化分析(上调基因) | 第158-161页 |
| 附表S8 VP添加TCA后"continuous"培养条件下的基因变化分析(下调基因) | 第161-165页 |
| 本研究中所用缩略语 | 第165-166页 |
| 致谢 | 第166-167页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第167-168页 |
