中文摘要 | 第4-6页 |
Abstract | 第6-7页 |
一、前言 | 第11-16页 |
二、材料与方法 | 第16-49页 |
1. 实验材料 | 第16-31页 |
1.1 细胞系 | 第16页 |
1.2 宿主菌 | 第16页 |
1.3 siRNA片断 | 第16页 |
1.4 单链RNA | 第16页 |
1.5 抗体 | 第16-17页 |
1.6 引物 | 第17-18页 |
1.7 实验试剂 | 第18-20页 |
1.8 实验试剂的配制 | 第20-28页 |
1.9 主要的仪器设备 | 第28-31页 |
2. 实验方法 | 第31-49页 |
2.1 质粒构建 | 第31-32页 |
2.2 酶切与连接 | 第32-33页 |
2.3 不依赖于链接酶的克隆(SLIC) | 第33-34页 |
2.4 定点突变 | 第34-36页 |
2.5 制备和转化感受态大肠杆菌 | 第36-37页 |
2.6 碱变性法制备质粒DNA | 第37-38页 |
2.7 细胞培养 | 第38-39页 |
2.8 细胞转染 | 第39-40页 |
2.9 TRNzol总RNA提取 | 第40页 |
2.10 cDNA合成 | 第40-41页 |
2.11 Cy5标记RT-PCR | 第41-42页 |
2.12 非变性PAGE及SMN1/2外显子7列入 | 第42页 |
2.13 SDS-PAGE电泳及Western Blot | 第42-43页 |
2.14 Hela核抽提液提取 | 第43-44页 |
2.15 RNA亲和色谱法 | 第44-45页 |
2.16 考马斯亮蓝染色 | 第45-46页 |
2.17 胶内酶解及质谱分析 | 第46页 |
2.18 MS2靶向实验 | 第46-47页 |
2.19 二级结构分析 | 第47页 |
2.20 公共数据库及网址 | 第47-48页 |
2.21 统计分析 | 第48-49页 |
三、结果 | 第49-64页 |
1. 53名患者中5例(0 SMN1/3 SMN2)的SMN1基因不完全转变 | 第49-50页 |
2. SMN1 C6T的pre-mRNA剪接效率比SMN2更有效 | 第50-52页 |
3. G-44A的转变减少了外显子7的列入 | 第52-53页 |
4. RNA二级结构与G-44A抑制效应无关 | 第53-55页 |
5. G-44A位点附近是剪接沉默子 | 第55-56页 |
6. 剪接沉默子的RNA结合蛋白的鉴定 | 第56-57页 |
7. HuR对SMN2外显子7剪接调控的抑制作用 | 第57-59页 |
8. HuR的RRM1\2结构域介导剪接抑制作用 | 第59-60页 |
9. AU-cluster促进HuR与pre-mRNA的结合 | 第60-61页 |
10. G-44A转变增强HuR与pre-mRNA的结合 | 第61-63页 |
小结 | 第63-64页 |
四、讨论 | 第64-67页 |
参考文献 | 第67-73页 |
综述:反义寡核苷酸的可变剪接调控 | 第73-93页 |
1. RNA剪接与可变剪接 | 第73-74页 |
2. 顺式作用元件对可变剪接调控机制 | 第74-75页 |
3. ASO作用分子机制 | 第75-76页 |
4. ASO发展及修饰 | 第76-78页 |
5. ASO药物开发 | 第78-81页 |
6. ASO筛选 | 第81-82页 |
7. ASO未来研究方向 | 第82-83页 |
参考文献 | 第83-93页 |
附录: 缩略词表 | 第93-95页 |
攻读学位期间发表的论文 | 第95-96页 |
致谢 | 第96页 |