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SMN2基因内含子6的A-44G置换改善脊髓性肌萎缩症的临床表型

中文摘要第4-6页
Abstract第6-7页
一、前言第11-16页
二、材料与方法第16-49页
    1. 实验材料第16-31页
        1.1 细胞系第16页
        1.2 宿主菌第16页
        1.3 siRNA片断第16页
        1.4 单链RNA第16页
        1.5 抗体第16-17页
        1.6 引物第17-18页
        1.7 实验试剂第18-20页
        1.8 实验试剂的配制第20-28页
        1.9 主要的仪器设备第28-31页
    2. 实验方法第31-49页
        2.1 质粒构建第31-32页
        2.2 酶切与连接第32-33页
        2.3 不依赖于链接酶的克隆(SLIC)第33-34页
        2.4 定点突变第34-36页
        2.5 制备和转化感受态大肠杆菌第36-37页
        2.6 碱变性法制备质粒DNA第37-38页
        2.7 细胞培养第38-39页
        2.8 细胞转染第39-40页
        2.9 TRNzol总RNA提取第40页
        2.10 cDNA合成第40-41页
        2.11 Cy5标记RT-PCR第41-42页
        2.12 非变性PAGE及SMN1/2外显子7列入第42页
        2.13 SDS-PAGE电泳及Western Blot第42-43页
        2.14 Hela核抽提液提取第43-44页
        2.15 RNA亲和色谱法第44-45页
        2.16 考马斯亮蓝染色第45-46页
        2.17 胶内酶解及质谱分析第46页
        2.18 MS2靶向实验第46-47页
        2.19 二级结构分析第47页
        2.20 公共数据库及网址第47-48页
        2.21 统计分析第48-49页
三、结果第49-64页
    1. 53名患者中5例(0 SMN1/3 SMN2)的SMN1基因不完全转变第49-50页
    2. SMN1 C6T的pre-mRNA剪接效率比SMN2更有效第50-52页
    3. G-44A的转变减少了外显子7的列入第52-53页
    4. RNA二级结构与G-44A抑制效应无关第53-55页
    5. G-44A位点附近是剪接沉默子第55-56页
    6. 剪接沉默子的RNA结合蛋白的鉴定第56-57页
    7. HuR对SMN2外显子7剪接调控的抑制作用第57-59页
    8. HuR的RRM1\2结构域介导剪接抑制作用第59-60页
    9. AU-cluster促进HuR与pre-mRNA的结合第60-61页
    10. G-44A转变增强HuR与pre-mRNA的结合第61-63页
    小结第63-64页
四、讨论第64-67页
参考文献第67-73页
综述:反义寡核苷酸的可变剪接调控第73-93页
    1. RNA剪接与可变剪接第73-74页
    2. 顺式作用元件对可变剪接调控机制第74-75页
    3. ASO作用分子机制第75-76页
    4. ASO发展及修饰第76-78页
    5. ASO药物开发第78-81页
    6. ASO筛选第81-82页
    7. ASO未来研究方向第82-83页
    参考文献第83-93页
附录: 缩略词表第93-95页
攻读学位期间发表的论文第95-96页
致谢第96页

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