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miRNA调节PD-1+耗竭性T细胞的作用机制研究

摘要第3-6页
ABSTRACT第6-8页
中英文缩略词表第13-17页
第1章 引言第17-26页
    1.1 概述第17-21页
        1.1.1 免疫负调控分子第17-19页
        1.1.2 免疫抑制细胞第19-20页
        1.1.3 可溶性细胞因子第20页
        1.1.4 代谢功能异常第20-21页
    1.2 耗竭性T细胞第21-23页
    1.3 PD-1/PD-L1通路第23-24页
    1.4 miRNA第24-26页
第2章 CD4+PD-1+和CD4+PD1T细胞miRNAs表达谱差异第26-57页
    2.1 材料第26-29页
        2.1.1 细胞及动物来源第26页
        2.1.2 miRNA芯片第26页
        2.1.3 主要试剂第26-28页
        2.1.4 主要仪器第28-29页
    2.2 方法第29-43页
        2.2.1 细胞培养第29-30页
        2.2.2 肿瘤模型建立第30页
        2.2.3 淋巴细胞分离第30-31页
        2.2.4 流式分选CD4+PD-1+和CD4+PD1 T淋巴细胞第31页
        2.2.5 miRNA提取第31-32页
        2.2.6 miRNA芯片第32-35页
        2.2.7 逆转录及cDNA合成第35页
        2.2.8 RT-qPCR第35-37页
        2.2.9 miRNA靶点预测第37页
        2.2.10 PmirGLO双荧光素酶质粒构建第37-42页
        2.2.11双荧光素酶试验鉴定miRNA的靶基因第42-43页
        2.2.12统计学分析第43页
    2.3 结果第43-53页
        2.3.1 流式分选CD4+PD-1+和CD4+PD1 T淋巴细胞第43-44页
        2.3.2 miRNA浓度及质量测定第44-45页
        2.3.3 miRNA芯片结果分析第45-47页
        2.3.4 Affymetrix GeneChip 3.0 miRNA芯片mi RNA引物序列第47-48页
        2.3.5 qPCR检测miRNA基因表达第48-49页
        2.3.6 miRNA靶点预测第49-53页
        2.3.7 双荧光素酶报告系统检测miRNA和PD-13’UTR的关系第53页
    2.4 讨论第53-57页
        2.4.1 PD-1+ T细胞在肿瘤环境中的意义第53-54页
        2.4.2 肿瘤相关miRNA第54页
        2.4.3 T淋巴细胞相关mi RNA第54-55页
        2.4.4 总结第55-57页
第3章 耗竭性T细胞在荷瘤小鼠中的表达及体外耗竭性T细胞模型建立第57-74页
    3.1 材料第57-59页
        3.1.1 细胞及动物来源第57页
        3.1.2 主要试剂第57-58页
        3.1.3 主要仪器及耗材第58-59页
    3.2 方法第59-65页
        3.2.1 细胞培养第59页
        3.2.2 肿瘤模型建立第59页
        3.2.3 淋巴细胞分离第59-60页
        3.2.4 肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)分离第60-61页
        3.2.5 流式细胞仪检测耗竭性T细胞表型第61页
        3.2.6 体外诱导耗竭性T细胞第61-62页
        3.2.7 体外诱导耗竭性T细胞的mi RNA表达变化第62-65页
        3.2.8 统计学分析第65页
    3.3 结果第65-71页
        3.3.1 肿瘤生长曲线第65-66页
        3.3.2 肿瘤中分离TILs第66页
        3.3.3 耗竭性T细胞在荷瘤小鼠中的表达升高第66-69页
        3.3.4 体外诱导耗竭性T细胞第69-71页
        3.3.5 体外培养耗竭性T细胞mi RNA变化第71页
    3.4 讨论第71-74页
第4章 miR-28调控耗竭性T细胞生物学特性的研究第74-101页
    4.1 材料第74-78页
        4.1.1 细胞及动物来源第74页
        4.1.2 主要试剂第74-76页
        4.1.3 主要仪器及耗材第76-78页
    4.2 方法第78-90页
        4.2.1 miR-28 mimic和miR-28 inhibitor瞬时转染第78页
        4.2.2 miRNA提取第78-79页
        4.2.3 miRNA逆转录第79页
        4.2.4 miRNA qPCR检测第79-80页
        4.2.5 琼脂糖凝胶电泳第80-81页
        4.2.6 mRNA逆转录第81页
        4.2.7 qRCR检测PD-1、TIM-3、BTLA基因表达第81-82页
        4.2.8 流式细胞仪检测耗竭性T细胞表型第82页
        4.2.9 Treg细胞、Foxp3+PD-1+及Foxp3+TIM-3+细胞检测第82-83页
        4.2.10 CFSE检测细胞增殖第83页
        4.2.11 Annexin V/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞凋亡第83-84页
        4.2.12 ELISA检测细胞因子分泌第84-85页
        4.2.13小鼠树突状细胞(dentrtic cell, DC)体外培养第85-86页
        4.2.14 MACs磁珠分选CD8+ T细胞第86-88页
        4.2.15 miR-28 mimic和miR-28 inhibitor瞬时转染第88页
        4.2.16 非放射性细胞毒性分析检测细胞介导的细胞毒性第88-90页
        4.2.17 统计学分析第90页
    4.3 结果第90-97页
        4.3.1 miR-28 mimic及miR-28 inhibitor改变T细胞中miR-28水平第90-91页
        4.3.2 miR-28对耗竭性T细胞相关基因表达的调控第91页
        4.3.3 miR-28对耗竭性T细胞表面负调控分子的影响第91-93页
        4.3.4 miR-28对Treg细胞的影响第93-94页
        4.3.5 miR-28对细胞增殖的影响第94-95页
        4.3.6 miR-28对T细胞凋亡的影响第95-96页
        4.3.7 miR-28对细胞因子分泌的影响第96页
        4.3.8 miR-28对细胞毒性T淋巴细胞的影响第96-97页
    4.4 讨论第97-101页
全文总结第101-104页
致谢第104-105页
参考文献第105-115页
攻读学位期间的研究成果第115-116页
综述第116-128页
    参考文献第123-128页

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