摘要 | 第3-6页 |
ABSTRACT | 第6-8页 |
中英文缩略词表 | 第13-17页 |
第1章 引言 | 第17-26页 |
1.1 概述 | 第17-21页 |
1.1.1 免疫负调控分子 | 第17-19页 |
1.1.2 免疫抑制细胞 | 第19-20页 |
1.1.3 可溶性细胞因子 | 第20页 |
1.1.4 代谢功能异常 | 第20-21页 |
1.2 耗竭性T细胞 | 第21-23页 |
1.3 PD-1/PD-L1通路 | 第23-24页 |
1.4 miRNA | 第24-26页 |
第2章 CD4+PD-1+和CD4+PD1T细胞miRNAs表达谱差异 | 第26-57页 |
2.1 材料 | 第26-29页 |
2.1.1 细胞及动物来源 | 第26页 |
2.1.2 miRNA芯片 | 第26页 |
2.1.3 主要试剂 | 第26-28页 |
2.1.4 主要仪器 | 第28-29页 |
2.2 方法 | 第29-43页 |
2.2.1 细胞培养 | 第29-30页 |
2.2.2 肿瘤模型建立 | 第30页 |
2.2.3 淋巴细胞分离 | 第30-31页 |
2.2.4 流式分选CD4+PD-1+和CD4+PD1 T淋巴细胞 | 第31页 |
2.2.5 miRNA提取 | 第31-32页 |
2.2.6 miRNA芯片 | 第32-35页 |
2.2.7 逆转录及cDNA合成 | 第35页 |
2.2.8 RT-qPCR | 第35-37页 |
2.2.9 miRNA靶点预测 | 第37页 |
2.2.10 PmirGLO双荧光素酶质粒构建 | 第37-42页 |
2.2.11双荧光素酶试验鉴定miRNA的靶基因 | 第42-43页 |
2.2.12统计学分析 | 第43页 |
2.3 结果 | 第43-53页 |
2.3.1 流式分选CD4+PD-1+和CD4+PD1 T淋巴细胞 | 第43-44页 |
2.3.2 miRNA浓度及质量测定 | 第44-45页 |
2.3.3 miRNA芯片结果分析 | 第45-47页 |
2.3.4 Affymetrix GeneChip 3.0 miRNA芯片mi RNA引物序列 | 第47-48页 |
2.3.5 qPCR检测miRNA基因表达 | 第48-49页 |
2.3.6 miRNA靶点预测 | 第49-53页 |
2.3.7 双荧光素酶报告系统检测miRNA和PD-13’UTR的关系 | 第53页 |
2.4 讨论 | 第53-57页 |
2.4.1 PD-1+ T细胞在肿瘤环境中的意义 | 第53-54页 |
2.4.2 肿瘤相关miRNA | 第54页 |
2.4.3 T淋巴细胞相关mi RNA | 第54-55页 |
2.4.4 总结 | 第55-57页 |
第3章 耗竭性T细胞在荷瘤小鼠中的表达及体外耗竭性T细胞模型建立 | 第57-74页 |
3.1 材料 | 第57-59页 |
3.1.1 细胞及动物来源 | 第57页 |
3.1.2 主要试剂 | 第57-58页 |
3.1.3 主要仪器及耗材 | 第58-59页 |
3.2 方法 | 第59-65页 |
3.2.1 细胞培养 | 第59页 |
3.2.2 肿瘤模型建立 | 第59页 |
3.2.3 淋巴细胞分离 | 第59-60页 |
3.2.4 肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)分离 | 第60-61页 |
3.2.5 流式细胞仪检测耗竭性T细胞表型 | 第61页 |
3.2.6 体外诱导耗竭性T细胞 | 第61-62页 |
3.2.7 体外诱导耗竭性T细胞的mi RNA表达变化 | 第62-65页 |
3.2.8 统计学分析 | 第65页 |
3.3 结果 | 第65-71页 |
3.3.1 肿瘤生长曲线 | 第65-66页 |
3.3.2 肿瘤中分离TILs | 第66页 |
3.3.3 耗竭性T细胞在荷瘤小鼠中的表达升高 | 第66-69页 |
3.3.4 体外诱导耗竭性T细胞 | 第69-71页 |
3.3.5 体外培养耗竭性T细胞mi RNA变化 | 第71页 |
3.4 讨论 | 第71-74页 |
第4章 miR-28调控耗竭性T细胞生物学特性的研究 | 第74-101页 |
4.1 材料 | 第74-78页 |
4.1.1 细胞及动物来源 | 第74页 |
4.1.2 主要试剂 | 第74-76页 |
4.1.3 主要仪器及耗材 | 第76-78页 |
4.2 方法 | 第78-90页 |
4.2.1 miR-28 mimic和miR-28 inhibitor瞬时转染 | 第78页 |
4.2.2 miRNA提取 | 第78-79页 |
4.2.3 miRNA逆转录 | 第79页 |
4.2.4 miRNA qPCR检测 | 第79-80页 |
4.2.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第80-81页 |
4.2.6 mRNA逆转录 | 第81页 |
4.2.7 qRCR检测PD-1、TIM-3、BTLA基因表达 | 第81-82页 |
4.2.8 流式细胞仪检测耗竭性T细胞表型 | 第82页 |
4.2.9 Treg细胞、Foxp3+PD-1+及Foxp3+TIM-3+细胞检测 | 第82-83页 |
4.2.10 CFSE检测细胞增殖 | 第83页 |
4.2.11 Annexin V/PI(Propidium Iodide)双染色法检测细胞凋亡 | 第83-84页 |
4.2.12 ELISA检测细胞因子分泌 | 第84-85页 |
4.2.13小鼠树突状细胞(dentrtic cell, DC)体外培养 | 第85-86页 |
4.2.14 MACs磁珠分选CD8+ T细胞 | 第86-88页 |
4.2.15 miR-28 mimic和miR-28 inhibitor瞬时转染 | 第88页 |
4.2.16 非放射性细胞毒性分析检测细胞介导的细胞毒性 | 第88-90页 |
4.2.17 统计学分析 | 第90页 |
4.3 结果 | 第90-97页 |
4.3.1 miR-28 mimic及miR-28 inhibitor改变T细胞中miR-28水平 | 第90-91页 |
4.3.2 miR-28对耗竭性T细胞相关基因表达的调控 | 第91页 |
4.3.3 miR-28对耗竭性T细胞表面负调控分子的影响 | 第91-93页 |
4.3.4 miR-28对Treg细胞的影响 | 第93-94页 |
4.3.5 miR-28对细胞增殖的影响 | 第94-95页 |
4.3.6 miR-28对T细胞凋亡的影响 | 第95-96页 |
4.3.7 miR-28对细胞因子分泌的影响 | 第96页 |
4.3.8 miR-28对细胞毒性T淋巴细胞的影响 | 第96-97页 |
4.4 讨论 | 第97-101页 |
全文总结 | 第101-104页 |
致谢 | 第104-105页 |
参考文献 | 第105-115页 |
攻读学位期间的研究成果 | 第115-116页 |
综述 | 第116-128页 |
参考文献 | 第123-128页 |