| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8页 |
| 缩略词表 | 第9-14页 |
| 第1章 前言 | 第14-32页 |
| 1.1 ROS(reactive oxygen species) | 第14-20页 |
| 1.1.1 ROS的产生 | 第14-15页 |
| 1.1.2 ROS的去除 | 第15-16页 |
| 1.1.3 氧化压力对生物大分子的损害 | 第16-17页 |
| 1.1.4 氧化压力对生理过程的损害 | 第17-18页 |
| 1.1.5 MAPK/Erk信号通路 | 第18-19页 |
| 1.1.6 氧化压力和Erk信号通路 | 第19-20页 |
| 1.2 肝脏发育 | 第20-23页 |
| 1.2.1 肝脏的结构和功能 | 第20-21页 |
| 1.2.2 肝脏发育、斑马鱼作为研究肝脏发育的优势 | 第21-23页 |
| 1.2.3 斑马鱼肝脏发育 | 第23页 |
| 1.3 肝脏发育中重要的信号途径 | 第23-29页 |
| 1.3.1 肝脏特化过程中的信号通路 | 第23-27页 |
| 1.3.2 影响肝脏细胞增殖的因子 | 第27-28页 |
| 1.3.3 肝脏发育过程中调节肝脏生长的小分子化合物 | 第28-29页 |
| 1.4 legl基因 | 第29-30页 |
| 1.5 课题研究意义 | 第30-32页 |
| 第2章 材料与方法 | 第32-53页 |
| 2.1 斑马鱼 | 第32-33页 |
| 2.1.1 斑马鱼品系及其饲养 | 第32页 |
| 2.1.2 斑马鱼的交配及受精卵的收集 | 第32-33页 |
| 2.1.3 未受精卵的收集 | 第33页 |
| 2.2 常规生化试剂及配方 | 第33-35页 |
| 2.3 细胞系培养及其转染 | 第35-36页 |
| 2.3.1 细胞系及其培养和冻存 | 第35页 |
| 2.3.2 细胞转染 | 第35-36页 |
| 2.4 DAN相关实验方法 | 第36-40页 |
| 2.4.1 克隆基因 | 第36-38页 |
| 2.4.2 定点突变/特定片段的删除 | 第38页 |
| 2.4.3 两个DNA片段的无缝拼接 | 第38-39页 |
| 2.4.4 斑马鱼胚胎、鱼鳞或尾鳍基因组DNA简易提取 | 第39页 |
| 2.4.5 斑马鱼细胞凋亡检测 | 第39-40页 |
| 2.5 RNA相关实验操作方法 | 第40-45页 |
| 2.5.1 斑马鱼胚胎或肝脏总RNA样品的提取 | 第40-41页 |
| 2.5.2 两步法RT-PCR | 第41页 |
| 2.5.3 mRNA的体外合成 | 第41-42页 |
| 2.5.4 Northern印记分析 | 第42-44页 |
| 2.5.5 斑马鱼整胚原位杂交(WISH) | 第44-45页 |
| 2.6 蛋白质相关操作方法 | 第45-49页 |
| 2.6.1 Western印记分析 | 第45-47页 |
| 2.6.2 斑马鱼冷冻切片的免疫荧光染色 | 第47-48页 |
| 2.6.3 蛋白免疫共沉淀 | 第48-49页 |
| 2.7 斑马鱼的操作 | 第49-51页 |
| 2.7.1 斑马鱼显微注射 | 第49-50页 |
| 2.7.2 斑马鱼胚胎压力处理 | 第50-51页 |
| 2.8 TALEN技术介绍 | 第51页 |
| 2.8.1 TALEN技术的具体原理 | 第51页 |
| 2.8.2 leg1TALEN质粒的构建 | 第51页 |
| 2.8.3 leg1 TALENs的显微注射和效率检测及获得突变体鉴定方法 | 第51页 |
| 2.9 Cas技术介绍 | 第51-52页 |
| 2.9.1 CRISPR/Cas定点突变技术原理 | 第51页 |
| 2.9.2 leg1 CRISPR/Cas9序列的设计和效率检测及获得突变体鉴定方法 | 第51-52页 |
| 2.10 本研究中涉及的引物列表 | 第52-53页 |
| 2.10.1 不同品系斑马鱼鉴定引物列表 | 第52页 |
| 2.10.2 点突变引物列表 | 第52页 |
| 2.10.3 TALEN和gRNA设计有关序列 | 第52-53页 |
| 第3章 leg1基因突变体斑马鱼的构建 | 第53-66页 |
| 3.1 TALEN定点突变技术 | 第53-57页 |
| 3.1.1 TALEN定点突变技术 | 第53-54页 |
| 3.1.2 TALENs定点突变技术原理 | 第54-55页 |
| 3.1.3 leg1 TALEN质粒的构建 | 第55-56页 |
| 3.1.4 leg1 TALENs的显微注射和效率检测 | 第56-57页 |
| 3.2 使用TALENs技术获得leg1突变体斑马鱼 | 第57-59页 |
| 3.2.1 可能获得的leg1突变体斑马鱼种类 | 第57-58页 |
| 3.2.2 leg1突变体斑马鱼的获得 | 第58-59页 |
| 3.3 CRISPR/Cas介导的定点突变技术 | 第59-64页 |
| 3.3.1 CRISPR/Cas定点突变技术原理 | 第59-61页 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9序列的设计 | 第61-62页 |
| 3.3.3 leg1b突变体斑马鱼的获得 | 第62-63页 |
| 3.3.4 leg1b突变体斑马鱼的筛选 | 第63-64页 |
| 3.4 leg1双突变体的获得 | 第64页 |
| 3.4.1 leg1a和leg1b双突变体的获得 | 第64页 |
| 3.5 小结与讨论 | 第64-66页 |
| 第4章 leg1~(zju1)突变体斑马鱼的研究 | 第66-73页 |
| 4.1 leg1~(zju1)突变体斑马鱼的突变位置 | 第66页 |
| 4.2 leg1~(zju1)突变体斑马鱼的外观表型 | 第66-67页 |
| 4.3 leg1~(zju1)突变体斑马鱼早期发育性状鉴定 | 第67-69页 |
| 4.3.1 leg1~(zju1)突变体斑马鱼的肝脏发育 | 第67-68页 |
| 4.3.2 比较leg1~(zju1) F2代胚胎中Leg1蛋白水平 | 第68-69页 |
| 4.4 消除母源效应之后的leg1~(zju1)突变体的研究 | 第69-71页 |
| 4.4.1 leg1~(zju1)母源-合子型突变体中Leg1蛋白的表达水平 | 第69-70页 |
| 4.4.2 leg1~(zju1)母源-合子型突变体肝脏表型研究 | 第70-71页 |
| 4.5 小结与讨论 | 第71-73页 |
| 第5章 Leg1a蛋白在逆境条件下保护斑马鱼肝脏发育 | 第73-79页 |
| 5.1 不同压力条件对leg1~(zju1)母源-合子型突变体斑马鱼肝脏发育的影响 | 第73-74页 |
| 5.2 Legla在2.5 mJ UV照射刺激下保护斑马鱼肝脏发育 | 第74-75页 |
| 5.3 低浓度双氧水刺激下leg1~(zju1)母源-合子型突变体肝脏发育受影响 | 第75-76页 |
| 5.4 活性氧抑制剂挽救压力条件下leg1~(zju1)母源-合子型突变体肝脏发育缺陷 | 第76-78页 |
| 5.5 本章小结 | 第78-79页 |
| 第6章 压力条件下Leg1a蛋白特异地保护斑马鱼肝脏发育 | 第79-84页 |
| 6.1 压力条件下Leg1a缺失特异地影响肝脏发育 | 第79-80页 |
| 6.2 压力条件下Leg1a缺失影响肝芽发生 | 第80-81页 |
| 6.3 压力条件下细胞周期阻滞导致leg1~(zju1)母源-合子型突变体小肝脏 | 第81-83页 |
| 6.4 本章小结 | 第83-84页 |
| 第7章 Leg1a通过激活Erk信号通路来保护肝脏发育 | 第84-92页 |
| 7.1 压力条件下,Leg1的表达量未发生改变 | 第84页 |
| 7.2 压力条件下Erk磷酸化水平增加 | 第84-85页 |
| 7.3 体外注射leg1a mRNA拯救突变体中Erk磷酸化的降低 | 第85-86页 |
| 7.4 BMP信号通路不参与Leg1对肝脏保护的机制 | 第86-87页 |
| 7.5 Leg1a通过激活Erk信号通路来保护肝脏发育 | 第87-91页 |
| 7.5.1 持续激活的Erk mRNA挽救实验 | 第88-89页 |
| 7.5.2 发育较后期注射Erk mRNA能挽救leg1~(zju1)母源-合子型突变体肝脏发育缺陷 | 第89页 |
| 7.5.3 注射可诱导caErk mRNA表达的质粒能挽救leg1~(zju1)母源-合子型突变体肝脏发育缺陷 | 第89-91页 |
| 7.6 本章小结 | 第91-92页 |
| 第8章 Leg1糖苷化修饰在压力条件下保护斑马鱼肝脏发育 | 第92-97页 |
| 8.1 压力条件下,N70位糖苷化修饰对于Leg1a保护斑马鱼肝脏发育是必须的 | 第92-93页 |
| 8.2 压力条件下,N70位糖苷化修饰突变的Leg1蛋白不能激活Erk的磷酸化 | 第93-94页 |
| 8.3 70N连接的糖苷化修饰对Leg1a蛋白与FGFR3相互作用至关重要 | 第94-95页 |
| 8.4 本章小结 | 第95-97页 |
| 第9章 结论与讨论 | 第97-102页 |
| 9.1 结论 | 第97-100页 |
| 9.2 讨论 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-121页 |
| 作者简介 | 第121-122页 |
| 致谢 | 第122-124页 |
